RP —HPLC法測定鞣云實素在不同PH條件下的含量變化

范源 徐國發(fā) 張建博 陳平 鄧玨力 林青

摘要：目的研究和分析鞣云實素在不同PH磷酸鹽緩沖液中的含量變化情況。方法采用在60℃的恒溫條件下觀察鞣云實素在不同PH的磷酸鹽緩沖液（PH分別為l、2、3、4、5、6、7、8）中的水解情況，應用反相高效液相色譜儀測定鞣云實素及其水解產(chǎn)物沒食子酸含量，并比較和分析鞣云實素樣品液水解前后鞣云實素和沒食子酸含量變化。結果緩沖溶液PH值在l～3范圍內(nèi)，鞣云實素隨著PH值的上升，其含量呈逐漸上升的趨勢，PH值在4～8范圍內(nèi)，鞣云實素隨著PH值的上升，其含量呈逐漸下降的趨勢，在PH值J～3范圍內(nèi)沒食子酸含量呈逐漸下降的趨勢，PH值在4～7的范圍內(nèi)，沒食子酸含量呈逐漸上升的趨勢，PH值在7～8的范圍內(nèi)，沒食子酸含量呈下降的趨勢。其中在PH值為l時鞣云實素的水解產(chǎn)物沒食子酸含量最高，在PH值為3時沒食子酸含量最低；結論鞣云實素在不同PH條件下的含量變化反映了酸堿度對鞣云實素水解反應的影響，本實驗研究可為含鞣云實素的中藥提取加工、養(yǎng)護、藥效學、穩(wěn)定性研究等方面的應用提供一定參考。

關鍵詞：鞣云實素；水解；沒食子酸；PH磷酸緩沖液

中圖分類號：R284

文獻標志碼：A

文章編號：1007-2349（2015） 01-0065-03鞣云實素（ Corilagin）是一種多酚類化合物，別名柯里拉京、鞣云實精，呈白色針晶狀粉末，分子式為C27H22018[1]，其化學結構見下圖。易溶于乙醇、甲醇、丙酮、稍溶于水。在冷水中溶解度小，容易被氧化和水解，樣品應置于陰暗低溫處避光保存[2-3]、鞣云實素存在于多種藥用植物中，其中葉下珠（Phyllanthus reticulatus）、橄欖（Canarium album）、余甘子（ Phyllallt11IIs enlblica）、老鸛草（Ceranium wilfordii）、龍眼（Di-mocarpus longana）等植物含量較多[4-7]。 藥理學研究表明，鞣云實素具有抗炎、保肝、抗- HIV、抗腫瘤、抗高血壓、抗氧化等多種生物活性，尤其在抗腫瘤、抗氧化方面藥效良好[8-13]。鞣云實素含有糖苷鍵，易水解斷裂脫落下一分子的沒食子酸，本實驗根據(jù)鞣云實素和沒食子酸的理化性質(zhì)，運用RP - HPLC法測定不同PH值條件下鞣云實素及水解產(chǎn)物沒食子酸的含量變化。1 實驗材料與儀器1.1實驗藥品鞣云實素樣品（購自上海同田生物技術有限公司）；鞣云實素對照品（購自上海同田生物技術有限公司）；沒食子酸對照品（購自昆明中檢所）；1.2儀器與試劑高效液相色譜儀（Agilent1200型）；分析天平；電子天平；精密PH測定儀計（0. 01pH）；恒溫水浴鍋；恒溫干燥箱；移液管；燒杯；玻璃棒；容量瓶；0.45um微孔濾膜；ImL注射器；無水甲醇（色譜純）；無水乙醇（色譜純）；磷酸（分析純）；磷酸氫二鈉（分析純）；醋酸（分析純）；純化水。2實驗方法2.1 磷酸鹽緩沖液的配制 A液：取磷酸10 mL，加純化水至100 mL，搖勻。B液：稱取磷酸氫二鈉7.163 g，加純化水使溶解成100 mL。分別取上述不同體積的A液和B液混合配制成不同PH（1、2、3、4、5、6、7、8）的磷酸鹽緩沖溶液，即得。2.2 對照品溶液的制備取沒食子酸對照品適量，于分析天平上精密稱定，加50%甲醇溶解配制定容成每l mL含25μg的溶液，即得；取鞣云實素對照品適量，于分析天平上精密稱定，用20%乙醇溶解定容成每lmL含20μg的溶液，即得。2.3供試品溶液的制備 取鞣云實素樣品適量，精密稱定5. 730 mg.以20%乙醇溶解定容配制成10 mL樣品溶液，取移液管分別吸取制備好的鞣云實素樣品溶液0.4 mL，放入固定體積的不同PH的磷酸鹽緩沖液中，超聲使其溶解混勻，以600C恒溫水浴鍋控制水浴環(huán)境溫度在（60±0.5）℃，讓鞣云實素樣品溶液在恒溫條件下充分水解2h，對水解后的樣品液用微孔濾膜（0. 45 um）進行過濾，即得供試品溶液。2.4色譜條件2.4.1鞣云實素色譜條件 色譜柱ZoRBAX SB - C18柱（4.6 x250 mm，5 um）；流動相：甲醇-0. 4%醋酸（22：78）；柱溫：250C；檢測波長：268 nm；流速：1 mL/min；進樣量：20 uL[14]。2.4.2沒食子酸色譜條件 色譜柱ZoRBAX SB - C18柱（4.6 x 250 mm，5 um）；流動相：甲醇-0. 2%磷酸（5：95）；柱溫：25℃；檢測波長：273 nm；流速：1mI/min；進樣量：10 uL。2.5標準曲線的繪制2.5.1 鞣云實素標準曲線的繪制 于分析天平上精密稱定鞣云實素對照品2. 860 mg，以20%乙醇溶解定容成25mL，配制成每1mL含0.1144 mg的溶液，分別取上述對照品溶液0.5、1、2、3、4、5 mL放入10 mL容量瓶中，用20%乙醇溶液稀釋至刻度配制成不同濃度的對照品溶液，按上述鞣云實素色譜條件進樣，以鞣云實素的峰面積（Y）對標準品的濃度（X）進行線性回歸，得回歸方程Y= 24877X - 68. 267，r=0.9987，結果表明：鞣云實素的峰面積值與濃度有良好的線性關系，線性范圍為：0. 0572 ug -0. 572 ug。2.5.2沒食子酸標準曲線的繪制 取沒食子酸對照品適量，于分析天平上精密稱定4. 45 mg，加50%甲醇溶解配制定容成25 mL，分別取上述對照品溶液0.5、1、2、3、4、5 mL于10 mL容量瓶中，用50%甲醇溶液稀釋至刻度配制成不同濃度的對照品溶液，按上述沒食子酸色譜條件分別進樣，以沒食子酸的峰面積（Y）對標準品濃度（X）進行線性回歸，得方程Y=23542x一1.7214，r=0.9995，結果表明：沒食子酸峰面積值與濃度有良好的線性關系，線性范圍為：0. 089 ug -0. 89 ug。2.6鞣云實素和沒食子酸的含量測定 分別取2.3項下方法制備的供試品溶液，按2.4色譜條件分別測定鞣云實素、沒食子酸在不同PH的磷酸鹽緩沖液條件下的含量，用標準曲線法進行計算。3 實驗結果與分析3.1 不同PH條件下鞣云實素和沒食子酸含量變化 見表1。3.2表l顯示：在緩沖液PH值為l～3的區(qū)間，隨著PH值的增大，鞣云實素含量逐漸增加，沒食子酸含量逐漸減少，且當緩沖液PH值等于l時，沒食子酸的含量最高，當緩沖液PH值等于3時，沒食子酸含量最低。表明在較酸性條件下，鞣云實素酯鍵斷裂水解產(chǎn)生較多的沒食子酸。3.3 從圖（3、4）中可以看出，當PH 4～7的范圍內(nèi)，鞣云實素含量逐漸下降，沒食子酸含量上升，PH 6～7范同鞣云實素含量急劇卜-降，而沒食子酸含量上升緩慢，大部分鞣云實素可能沒有水解出沒食子酸，其有可能被氧化或水解成其他化合物。當PH 7—8時鞣云實素含量下降，而沒食子酸含量也在下降，鞣云實素水解產(chǎn)生沒食子酸的速度小于沒食子酸消耗的速度.上述結果可能和沒食子酸在堿性條件下不穩(wěn)定而產(chǎn)生紅棓酚等物質(zhì)有關[15]。4結論鞣云實素是存在于多種藥用植物中的活性成分，其有較重要的藥效學功效。本實驗結果所顯示鞣云實素在不同的PH值條件下的含量變化提示鞣云實素的酯鍵或苷鍵在酸性條件下可能更容易斷裂產(chǎn)生沒食子酸。進一步研究并分析鞣云實素的理化特性，可為進一步研究含鞣云實素的中藥加工工藝、質(zhì)控、養(yǎng)護及藥效學提供一定的參考.參考文獻：[l]陳玉武，蜜柑草抗癌有效成份研究Ⅱ.多酚類成分的分離與 鑒定[J].中草藥，1997，28（4）：198 -202.[2]萬振先.葉下珠化學成分的研究[J].中草藥，1997，28（3）：134 - 135.[3]沙東旭，葉下珠化學成分的研究[J].沈陽藥科大學學報，2000，17（3）：176 - 178.[4]陳玉武，蜜柑草抗癌有效成份研究Ⅱ.多酚類成分的分離與鑒定[J].中草藥，1997，28（4）：198 -202.[5] Kumaran A，et al. Nitric oxide radical scavenging active components from Phyllanthus emblica L[J]. Plant Foods Hum Nutr. ，2006，61（1）：l一5.[6]S Kinoshita et al.Free radical scavenging action of meclicinal herbs from Mongolia[J].Phytomedicine ，2007 ，14（11）：755-762.[7]張樹峰，明艷林，林毅，等.葉下珠屬植物活性成分柯里托京研究進展[J]植物科學，2010，39（4）：79 -83.[8] Xu H X， et al.Inhibitory activity of flavonoids and tannins against HIV-l protease[J].Biol Pharm Bull. 2000 ，23（9）：1072 - 1076.[9]沈志強，葉下珠有效部位的溶栓作用及其對PAI -l和tPA活性的影響[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2003，15：441-445.[10] Zhao S L，et al.Preliminary exploration on anti - inflammatory mechanism of Corilagin[ beta -I -O- galloyl -3，6-（ R） – bexa hydroxydiphenoyl -d - glucose] in Vitro[J].Int Immunopharmacol，2008，8（7）：1059 - 1064.[11]劉朝陽.柯里拉京抗腫瘤和致突變作用實驗研究[J].腫瘤防治雜志，2003，10（5）：469 - 472.[12]劉朝陽.柯里拉京抗腫瘤作用的研究[J].腫瘤防治研究，2002，29（5）：356 -358. [13] Luoqi Jia， Hongyan Jin， Jiayi Zhou， et al，A potential anti – tumor herbal medicine，Corilagin，inhibits ovarian Cancer cell growth through blocking the TCF -p signaling pathways[J].BioMed Central. 2013，33 （13）：1- 11.[14]陳曉北，HPLC法測定珠子肝泰分散片中鞣云實精的含量[J].遼寧壓虧院學報，2008，29（1）40 -43.[15]張迎杰，傅杰，劉林，等，沒食子酸在含鹽酸高溫液態(tài)水中的穩(wěn)定性[J].化學反應工程與-二藝，2013，29（2）：189-19.（收稿日期：2014-11-10）