pH值響應(yīng)聚乙二醇化殼聚糖基隱形納米膠束的制備 及其載藥性能

姚文杰，辛梅華，李明春，方江海

（華僑大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，環(huán)境友好功能材料教育部工程研究中心，福建 廈門(mén) 361021）

近年來(lái)，可明顯提高藥物體內(nèi)半衰期，增強(qiáng)藥物靶向性及療效的聚乙二醇（PEG）化隱形納米膠束逐漸受到人們的重視[1]。PEG化隱形納米膠束是在PEG化的基礎(chǔ)上降低膠束粒徑至100nm左右，從而進(jìn)一步降低網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對(duì)其識(shí)別和攝取能力，延長(zhǎng)在血液循環(huán)滯留時(shí)間[2-3]。 Praneet等[4]制備了N-鄰苯二甲?；?3-mPEG-殼聚糖自組裝納米膠束，并以喜樹(shù)堿為模型藥物研究了藥物包埋和釋放行為。結(jié)果表明，在pH值為7.4的PBS模擬液中該聚合物具有較高穩(wěn)定性和藥物緩釋性能，膠束平均粒徑為200～267nm。Wang等[5]利用十八烷基季胺化賴(lài)氨酸對(duì)殼聚糖改性后（OQLS），分別接枝mPEG和FA（葉酸），制得mPEG-OQLS和FA-OQLS。將兩者混合形成了具有主動(dòng)靶向的隱形納米微囊，其平均粒徑達(dá)160nm，但產(chǎn)物僅溶于氯仿不溶于水，無(wú)法應(yīng)用于疏水藥物的包載。因此制備能水溶的PEG化雙親性聚合物膠束成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

李昆等[6]制備了水溶雙親性N-辛基化-N-mPEG化殼聚糖，并對(duì)產(chǎn)物包覆量子點(diǎn)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)聚合物納米粒子為球形，且分布較為均一，粒徑為200nm左右。Jong等[7]制備了PEG化聚天冬酰胺衍生物，在PBS模擬液中pH值為7.4時(shí)，膠束穩(wěn)定性高且具有緩釋性能，在pH值為6.5時(shí)，出現(xiàn)突釋現(xiàn)象，該研究為實(shí)現(xiàn)藥物在人體的主動(dòng)靶向釋放提供了可能性。作者課題組[8]曾制備高取代度的N,N-雙十二烷基殼聚糖，能溶于氯仿和四氫呋喃。烷基鏈取代度增加，載藥量增加，臨界膠束濃度和膠束粒徑減小[9-10]。但高取代N,N-雙烷基殼聚糖的疏水性強(qiáng)，而mPEG羧基化和鹵化改性在殼聚糖的羥基上接枝率低[6，11]，不易形成水溶性雙親性衍生物。為此，本文提出一種新的方法，將mPEG經(jīng)氯乙酸羧化改性后，通過(guò)?；磻?yīng)接枝到雙烷基殼聚糖的羥基上，制備出高接枝度N,N-雙烷基-3,6-O-mPEG-殼聚糖（PEDLCS）水溶性衍生物，合成路線(xiàn)見(jiàn)圖1，并以酮洛芬為疏水模型藥物，對(duì)產(chǎn)物在水中的自組裝行為進(jìn)行研究，為其在疏水藥物增溶中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

FD-1B-50型冷凍干燥機(jī)（博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器公司）；FLS920型全功能穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀（Edinburgh Instruments）；Nexusu 470 型傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet）；Bruker Avance III 型（500 MHz）核磁共振波譜儀（Bruker）；Vario MICRO元素分析儀（Elementar）；ZEN3600納米激光粒度及zeta電位分析儀（malvern）。

殼聚糖（CS，Mw=50kDa，DD=90.95%），浙江澳興生物科技有限公司；月桂醛（95%），二氯亞砜（99%），聚乙二醇單甲醚（mPEG，Mn= 1000Da），阿拉丁試劑；十二烷基磺酸鈉（SDS），NaBH4（99%），上海國(guó)藥集團(tuán)；氯乙酸（99%），天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；酮洛芬（KP），武穴市迅達(dá)藥業(yè)；其他試劑均為市售分析純。

1.2 mPEG-COOH的合成

[12]方法，將10.0g mPEG溶于40mL 20% NaOH溶液中，攪拌1h，緩慢滴加氯乙酸水溶液（4.7g氯乙酸溶于5mL水中），60℃反應(yīng)6h。用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至中性，旋蒸除水，得白色固體。干燥，乙醚洗滌，再將產(chǎn)物溶于少量氯仿中，冰乙醚沉析，抽濾得目標(biāo)產(chǎn)物mPEG-COOH。

圖1 PEDLCS的合成路線(xiàn)

1.3 N,N-雙十二烷基-3,6-O-mPEG-殼聚糖的合成

首先采用作者課題組方法[8]合成油溶性的N,N-雙十二烷基殼聚糖（DLCS）。再參考文獻(xiàn)[13]方法，將7g mPEG-COOH溶于20mL氯仿中，冰浴下攪拌0.5h，回流管上接干燥管，緩慢滴加2mL二氯亞砜1h。再滴加DLCS的氯仿溶液（0.5g DLCS溶于20mL氯仿中），室溫反應(yīng)1h后60℃反應(yīng)7h。旋蒸除氯仿后溶于丙酮，過(guò)濾，濾液濃縮后的產(chǎn)物溶于水，用透析袋在蒸餾水中充分透析，冷凍干燥得產(chǎn)物N,N-雙十二烷基-3,6-O-mPEG-殼聚糖（PEDLCS）。

1.4 PEDLCS載酮洛芬膠束的制備

參考文獻(xiàn)[10]的方法，準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1gN,N-雙十二烷基-3,6-O-mPEG-殼聚糖溶解于50mL pH值為7.4的PBS緩沖溶液中，平均分成5份。100mg酮洛芬溶于3mL乙醇中，按一定比例量取酮洛芬（KP）溶液分別加入上述PEDLCS水溶液中，室溫超聲30min，蒸餾水透析12h。12000r/min離心10min，0.45μm濾膜過(guò)濾，濾液凍干至恒重得載藥膠束粉末，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 載藥量和包封率測(cè)定

取1.4節(jié)制備的載酮洛芬膠束溶于1mL的PBS緩沖溶液中。移取0.2mL膠束溶液于10mL容量瓶中，乙醇定容，12000r/min離心10min，取上清液在260nm測(cè)定吸光值A(chǔ)，根據(jù)酮洛芬乙醇溶液的線(xiàn)性方程A=72.902C+0.0205（R2=0.9994），C為酮洛芬膠束濃度，單位mg/mL，線(xiàn)性范圍0～0.025 mg/mL，求得膠束內(nèi)酮洛芬的質(zhì)量。計(jì)算包封率和載藥量。

式中，m1為加入的KP總質(zhì)量；m2為膠束內(nèi)KP的質(zhì)量；m為載體的質(zhì)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)物的表征

2.1.1 產(chǎn)物的FTIR分析

圖2 合成產(chǎn)物的FTIR圖

采用KBr壓片法，測(cè)得N,N-雙十二烷基殼聚糖（DLCS）、聚乙二醇單甲醚（mPEG）、羧化改性聚乙二醇單甲醚（mPEG-COOH）、N,N-雙十二烷基-3,6-O-mPEG-殼聚糖（PEDLCS）的紅外光譜如圖2所示。圖中b、c分別為mPEG和mPEG- COOH的FTIR譜圖，2870cm-1附近的吸收峰為聚 乙二醇重復(fù)單元（—CH2—CH2—O—）中C—H的伸縮振動(dòng)峰，1100cm-1附近為mPEG中醚鍵C—O—C的伸縮振動(dòng)峰；c與b相比，1723cm-1附近出現(xiàn)了羧基中的C=O伸縮振動(dòng)峰[15]，說(shuō)明mPEG已羧化改性。 a、d分別為DLCS和PEDLCS的FTIR譜圖，d與a相比，d在2928cm-1、2860cm-1和721cm-1處出現(xiàn)同樣的特征吸收峰，2928和2860cm-1處為甲基和亞甲基的C—H伸縮振動(dòng)峰，721cm-1為n≥4的(CH4)n基團(tuán)的骨架振動(dòng)峰，說(shuō)明長(zhǎng)鏈烷基已接到殼聚糖上[8]。且b與d相比，d在1636cm-1、1458cm-1、1350cm-1和1100cm-1處出現(xiàn)了mPEG骨架的特征峰[11]，說(shuō)明mPEG已接枝到DLCS上得到目標(biāo)產(chǎn)物。

2.1.2 產(chǎn)物的1H NMR分析

圖3 PEDLCS的1H NMR圖

以D2O為溶劑測(cè)得PEDLCS的1H NMR圖如圖3，其中δ3.44～3.89為殼聚糖骨架上H3、H4、 H5、H6的質(zhì)子峰。δ2.32為十二烷基與氨基相連的亞甲基的質(zhì)子峰，δ1.2附近為十二烷基上亞甲基的質(zhì)子峰，δ0.81為十二烷基的甲基質(zhì)子峰，說(shuō)明長(zhǎng)鏈烷基已經(jīng)接到殼聚糖的氨基上[5]。δ3.29為—O—CH3(d)中H(d)的質(zhì)子峰，δ3.62為—CH2—CH2(e)—O—CH2—中H(e)的 質(zhì) 子 峰，δ4.28為CH3O(CH2CH2O)z+1CH2(f)CO—中H(f)的質(zhì)子峰，說(shuō)明mPEG已經(jīng)接枝到雙烷基殼聚糖上[15]。由1H NMR譜圖進(jìn)一步說(shuō)明已合成了目標(biāo)產(chǎn)物PEDLCS。

2.1.3 產(chǎn)物的取代度測(cè)定

產(chǎn)物的元素分析及由C/N 摩爾比計(jì)算取代度[9]結(jié)果見(jiàn)表1。殼聚糖的脫乙酰度為90.95%，十二烷基取代度為1.89，烷基鏈取代度是已報(bào)道[9-10]的兩親性烷基殼聚糖衍生物的近2倍 ，疏水鏈取代度高有利于形成粒徑較小的聚合物膠束[10]。mPEG接枝率為1.63，與文獻(xiàn)報(bào)道的16.5%[4]和29%[11]mPEG相比，接枝度有較大的提高，mPEG的接枝率高可以增加產(chǎn)物的親水能力使產(chǎn)物溶于水，并且大量mPEG的存在保障了所形成載藥膠束的長(zhǎng)循環(huán)功 能[1]。

2.1.4 產(chǎn)物的溶解性試驗(yàn)

稱(chēng)取0.1g產(chǎn)物于100mL溶劑中，觀察溶解情況，結(jié)果見(jiàn)表2。殼聚糖（CS）只有在弱酸性條件下可以溶解，這是由于殼聚糖分子內(nèi)和分子間的氫鍵作用。N,N-雙十二烷基殼聚糖（DLCS） 只溶于四氫呋喃和氯仿而不溶于水，N,N-雙十二烷 基-3,6-O-mPEG-殼聚糖（PEDLCS）不僅能溶于酸性、中性和堿性水溶液中，而且能溶于除乙醚之外 的大部分有機(jī)溶劑，可見(jiàn)mPEG鏈的高接枝率拓寬了目標(biāo)產(chǎn)物PEDLCS的溶解性能，是一種少有的兩親性聚合物。

表1 產(chǎn)物的元素分析結(jié)果及取代度

表2 原料及產(chǎn)物的溶解性

2.2 產(chǎn)物的載藥性能以及載藥膠束的pH值響應(yīng)性

2.2.1 臨界膠束濃度

以芘為熒光探針，采用穩(wěn)態(tài)熒光法測(cè)定N,N-雙十二烷基-3,6-O-mPEG-殼聚糖（PEDLCS）的臨界膠束濃度（CMC）[14]。配制一系列含不同濃度芘的PEDLCS水溶液，選擇激發(fā)波長(zhǎng)335nm，掃描范圍350～450nm，狹縫寬度0.6nm測(cè)其穩(wěn)態(tài)熒光光譜，進(jìn)一步計(jì)算并繪制lgC～I(xiàn)372/I383關(guān)系曲線(xiàn)如圖4所示。分段做曲線(xiàn)的切線(xiàn)，切線(xiàn)的交點(diǎn)對(duì)應(yīng)的濃度即為PEDLCS的CMC值0.1170 mg/mL，比文獻(xiàn)[4]報(bào)道的mPEG化殼聚糖基藥物載體材料的CMC值28μg/L小，CMC值小有利于在體內(nèi)循環(huán)被稀釋時(shí)膠束的穩(wěn)定存在。

2.2.2 載藥膠束粒徑、Zeta電位及包封率和載藥量的測(cè)定

按照實(shí)驗(yàn)部分1.4節(jié)操作，制備N(xiāo),N-雙十二烷基-3,6-O-mPEG-殼聚糖自組裝載酮洛芬膠束。測(cè)得不同KP/PEDLCS投料比的PEDLCS載藥膠束的載藥量、包封率、粒徑和Zeta電位見(jiàn)表3，可見(jiàn)隨著KP/PEDLCS投料比從0.6∶1增大到1.4∶1，包封率從79.85%下降到45.88%，載藥量從32.39%增大到39.11%。載藥膠束的粒徑隨著載藥量增大呈現(xiàn)先減小再增大的趨勢(shì)，Zeta電位的絕對(duì)值都在30 mV左右，說(shuō)明載藥膠束都具有良好的穩(wěn)定性。粒徑較小有利于實(shí)現(xiàn)膠束在體內(nèi)的隱形性，達(dá)到長(zhǎng)循環(huán)，因此選擇最佳KP/PEDLCS投料比0.8∶1制備載藥膠束，平均粒徑為155.1nm，此時(shí)包封率為65.78%，載藥量為34.48%；與文獻(xiàn)報(bào)道的200～267nm[4]、220.2nm[15]和167.5nm[5]相比具有較小的 粒徑。可見(jiàn)，引入mPEG親水基團(tuán)不僅使產(chǎn)物可以形成穩(wěn)定膠束，對(duì)KP有較高的包封率和載藥量，而且形成的聚合物膠束粒徑較小，有望成為殼聚糖基隱形納米膠束。

圖4 芘的熒光發(fā)射強(qiáng)度比（I372/I383）與 PEDLCS濃度關(guān)系曲線(xiàn)

表3 PEDLCS載酮洛芬聚合物膠束的性能參數(shù)

2.2.3 載藥膠束在不同pH值條件下的響應(yīng)性

采用KP/PEDLCS質(zhì)量比為0.8∶1，按照1.3節(jié)制得的載藥膠束具有良好的pH值響應(yīng)性。在pH值5.5時(shí)膠束呈絮凝狀，緩慢滴加PBS緩沖溶液，隨著pH值的逐漸增大，在6.0左右凝聚物快速消失，繼續(xù)增大pH值膠束呈現(xiàn)透明狀；再次調(diào)節(jié)pH＜6.0時(shí)，凝聚物又迅速出現(xiàn)，可見(jiàn)PEDLCS載藥膠束呈現(xiàn)出較優(yōu)越的pH值敏感性。這可能是由于產(chǎn)物中氮雙烷基的存在，在pH值7.4～5.5反復(fù)調(diào)節(jié)時(shí)，聚合物膠束質(zhì)子化和去質(zhì)子化作用的結(jié) 果[7]。

把KP/PEDLCS=0.8∶1制得的載藥和空白膠束復(fù)溶于不同pH值的PBS溶液中，用納米激光粒度及Zeta電位分析儀測(cè)定粒徑和Zeta電位，結(jié)果見(jiàn)表4。可見(jiàn)，隨著pH值從7.4降低到6.5，空白膠束粒徑變大，粒徑分散指數(shù)從0.155增大到0.359，Zeta電位的絕對(duì)值降低；載藥膠束的粒徑由158.4nm增大到345.8nm，粒徑分布由單峰變成雙峰（圖5），粒徑隨pH值降低而增大，并且Zeta電位的絕對(duì)值由31.5降低到7.95。以上實(shí)驗(yàn)說(shuō)明隨著pH值的降低，載藥膠束和空白膠束的穩(wěn)定性降低，粒徑有增大的趨勢(shì)，PEDLCS具有pH值響應(yīng)性，其響應(yīng)范圍符合癌細(xì)胞微環(huán)境（pH值7.2～6.0）[16]。

表4 不同pH值條件下空白膠束和載藥膠束的性能參數(shù)

圖5 載藥膠束在pH值為7.4(a)和6.5(b)的粒徑分布

3 結(jié) 論

mPEG先用氯乙酸羧化改性，再通過(guò)酰化反應(yīng)接枝到雙烷基殼聚糖上，制得高取代度的N,N-雙十二烷基-3,6-O-mPEG-殼聚糖（PEDLCS）衍生物，其中烷基取代度為1.89，mPEG接枝度為1.63。PEDLCS溶于水和除乙醚外的大部分有機(jī)溶劑，在水溶液中能自組裝形成粒徑較小的穩(wěn)定膠束，較小的粒徑和較高的mPEG接枝度有利于實(shí)現(xiàn)膠束在人體的長(zhǎng)循環(huán)，從而達(dá)到隱形性。pH值響應(yīng)范圍符合癌細(xì)胞微環(huán)境（pH值7.2～6.0），有望成為具有pH值響應(yīng)主動(dòng)靶向的隱形納米膠束。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Koshkaryev A，Sawant R，Deshpande M，et al. Immunoconjugates and long circulating systems：Origins，current state of the art and future directions[J].Advanced Drug Delivery Reviews，2013，65：24-35.

[2] 顧芃，陳建明. PEG化隱形納米脂質(zhì)體的研究進(jìn)展[J]. 藥學(xué)與臨床研究，2011，19（1）：47-50.

[3] Pignatello R，Leonardi A，Pellitteri R，et al. Evaluation of new amphiphilic PEG derivatives for preparing stealth lipid nanoparticles[J].Colloids and Surfaces A：Physicochemical and Engineering Aspects，2013，434：136-144.

[4] Praneet O，Tanasait N，Amornrut C，et al. Incorporation of camptothecin intoN-phthaloyl chitosan-g-Mpeg self-assembly micellar system[J].European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics，2006，64：269-276.

[5] Wang H J，Zhao P Q，Liang X F，et al. Folate-PEG coated cationic modified chitosan——Cholesterol liposomes for tumor-targeted drug delivery[J].Biomaterials，2010，31：4129-4138.

[6] 李昆，孫婷，孫媛，等. 兩親性殼聚糖衍生物的制備及其包覆量子點(diǎn)[J]. 高分子學(xué)報(bào)，2012，2：180-186.

[7] Jong R M，Young S J，Miklos Z et al. pH-Responsive PEGylated nanoparticles based on amphiphilic polyaspartamide：Preparation，physicochemical characterization and in vitro evaluation[J].Polymer International，2013，62：1218-1224.

[8] 周景潤(rùn)，辛梅華，李明春，等.O-季銨鹽-N,N-雙長(zhǎng)鏈烷基殼聚糖的制備及其性能[J]. 化工進(jìn)展，2008，27（10）：1654-1658.

[9] Huo M，Zhang Yong，Zhou J P，et al. Synthesis and characterization of low-toxic amphiphilic chitosan derivatives and their application as micelle carrier for antitumor drug[J].International Journal of Pharmaceutics，2010，394：162-173.

[10] Huo M，Zhang Yong，Zhou J P，et al. Formation，microstructure，biodistribution and absence of toxicity of polymeric micelles formed byN-octyl-N,O-carboxymethyl chitosan[J].Carbohydrate Polymers，2011，83：1959-1969.

[11] Lin W J，Chen T D，Liu C W. Synthesis and characterization of lactobionic acid grafted pegylated chitosan and nanoparticle complex application[J].Polymer，2009，50：4166-4174.

[12] Pushpamalar V，Langford S J，Ahmad M，et al. Optimization of reaction conditions for preparing carboxymethyl cellulose from sago waste[J].Carbohydrate Polymers，2006，64（2）：312-318.

[13] He X，Zhang F，Wang R，et al. Preparation of a carbon nanotube/carbon fiber multi-scale reinforcement by grafting multi-walled carbon nanotubes onto the fibers[J].Carbon，2007，45 （13）：2559-2563.

[14] Wu Y，Zheng Y，Yang W，et al. Synthesis and characterization of a novel amphiphilic chitosan-polylactide graft copolymer[J].Carbohydrate Polymers，2005，59（2）：165-171.

[15] Liang X，Sun Y，Duan Y，et al. Synthesis and characterization of PEG‐graft‐quaternized chitosan and cationic polymeric liposomes for drug delivery[J].Journal of Applied Polymer Science，2012，125（2）：1302-1309.

[16] 許金霞，唐建斌，趙魯杭，等. 腫瘤 pH 響應(yīng)的聚合物膠束用于腫瘤藥物靶向輸送的研究進(jìn)展[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，2009，44（12）：1328-1335.