紫外分光光度法測定乳與乳制品中硫氰酸鈉的含量

何瑛 林木娣 賴書瑩 劉傳栩 梁俊健

摘 要：本文建立了使用紫外分光光度計(jì)測定原料乳及乳制品中硫氰酸鈉含量的方法，方法利用硫氰酸鈉與硝酸鐵反應(yīng)產(chǎn)物硫氰酸鐵的光度值間接測定硫氰酸鈉的含量。結(jié)果顯示，吸光度與硫氰酸鈉質(zhì)量濃度線性關(guān)系、檢出限實(shí)驗(yàn)、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)、回收率實(shí)驗(yàn)等方法學(xué)實(shí)驗(yàn)均效果良好，測得結(jié)果與離子色譜法結(jié)果沒有顯著性差異，提示方法可行，適于乳品企業(yè)對硫氰酸鈉的快速檢測。

關(guān)鍵詞：硫氰酸鈉 紫外分光光度法 硝酸鐵 乳及乳制品硫氰酸鈉（NaSCN）是生乳中天然存在的一種活性抗菌體系，其乳過氧化物酶體系（LPS）可以抑菌保鮮。1991年，WHO和FAO的食品法典委員會公布的CAC/GL 13-1991《乳過氧化物酶體系用于原料乳的保鮮指南》中，硫氰酸鈉作為LPS的活化劑[1]被允許添加到牛奶中；我國也于隨后頒布標(biāo)準(zhǔn)，允許將其添加到無冷鏈運(yùn)輸體系中用于原料乳保鮮，添加量為15mg/L[2～3]。

但硫氰酸鈉屬有毒有害物質(zhì)，其主要毒性作用為以抑制細(xì)胞色素氧化酶活性為主的急性毒性與以抑制碘轉(zhuǎn)運(yùn)及甲狀腺素合成的慢性毒性，尤其對胎兒和嬰兒的腦部與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育存在較大的危害[4]。隨著社會對食品安全重視度提高及原奶冷鏈運(yùn)輸?shù)耐晟疲瑖覐U除了之前的標(biāo)準(zhǔn)并于2008年12月公布《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單（第一批）》，規(guī)定乳及乳制品中硫氰酸鈉屬違法添加物質(zhì)。

目前，我國尚未制定檢測牛奶中硫氰酸鈉的標(biāo)準(zhǔn)及限值。本文采用紫外分光光度法測定牛奶中硫氰酸鈉含量，與離子色譜法相比，其操作簡捷且結(jié)果準(zhǔn)確，儀器易普及，適合在各乳品企業(yè)推廣使用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

生乳采自廣東、福建、廣西、天津等地的奶牛場；原料乳粉為新西蘭進(jìn)口奶粉；乳制品包括市售巴氏殺菌乳、UHT滅菌乳、調(diào)制乳等。

1.1.2 試劑

1.1.2.1 三氯乙酸溶液（200g/L）：稱取三氯乙酸200.0g，用純水溶解并稀釋至1000mL；

1.1.2.2 硝酸鐵溶液（16g/L）：稱取硝酸鐵（Fe（NO3）3·9H2O）2.674g，用純水溶解并稀釋至100mL，加入2mL濃硝酸，避光保存；

1.1.2.3 硫氰酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1000mg/L）：將硫氰酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品（光譜純，GR）置于80℃烘箱內(nèi)干燥2h，準(zhǔn)確稱取干燥后的硫氰酸鈉0.1000g于100mL容量瓶中，用純水定容至刻度，混勻后置于4℃避光保存；

1.1.2.4 硫氰酸鈉標(biāo)準(zhǔn)工作液（100mg/L）：準(zhǔn)確吸取1.00mL硫氰酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲備液到10mL容量瓶中，用純水定容至刻度，混勻后備用，該試劑應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。除非另有說明，本實(shí)驗(yàn)中使用的均為分析純試劑和GB/T 6682-2008中規(guī)定的一級水。

1.1.3 儀器設(shè)備

UV-1800紫外可見分光光度計(jì)，電子分析天平，離心機(jī)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，渦旋振蕩器，移液槍。

1.2 方法建立

1.2.1 實(shí)驗(yàn)原理

牛奶中加入三氯乙酸（TCA）除去蛋白質(zhì)和脂肪，過濾后取上清液加入高鐵化合物，利用硫氰酸根與三價(jià)鐵離子在pH值為1.0～1.5的條件下反應(yīng)生成血紅色的硫氰酸鐵絡(luò)合物[5]，在最大吸收波長處測定吸光度值，根據(jù)吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線確定其中硫氰酸鈉的含量。

1.2.2 樣品處理

（1）生乳或液態(tài)乳制品：吸取15mL樣品于50mL的離心管中，邊振搖邊加入三氯乙酸溶液（1.1.2.1）10mL，充分混勻后靜置15～30min，然后將樣品離心（9000rad/min，3min）分離，上清液經(jīng)定性濾紙雙層過濾、棄去初濾液后待測。（2）乳粉：稱取10.0g奶粉于200mL燒杯中，用65～80℃溫水1︰10進(jìn)行溶解，冷卻后吸取該溶液15mL于50mL離心管，同1.2.2.1處理。

1.2.3 樣品測定

分別吸取4mL待測液于10mL比色管中，加入2mL硝酸鐵溶液（1.1.2.2），混勻，反應(yīng)10min后在450nm波長處測定吸光度值，以三氯乙酸溶液加顯色劑作為試劑空白調(diào)零。測得的反應(yīng)液吸光值應(yīng)減去樣品濾液的本底吸光值，得到凈吸光值，將凈吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中硫氰酸鈉的含量。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取10mL比色管7支，選擇反應(yīng)液凈吸光度值與試劑空白最接近的樣品濾液作底液，分別吸取0、20、40、80、160、320、640μL硫氰酸鈉標(biāo)準(zhǔn)工作液（1.1.2.4），用底液定容至4mL，配制成濃度為0、0.5、1、2、4、8、16mg/L的硫氰酸鈉基質(zhì)加標(biāo)溶液，然后加入2mL硝酸鐵溶液混勻后靜置10min顯色，以試劑空白調(diào)零，在450nm波長處測定吸光度值，將測得的吸光值減去底液吸光值后得到的凈吸光值對硫氰酸鈉質(zhì)量濃度作圖。

1.2.5 計(jì)算

樣品中硫氰酸鈉的含量按以下公式進(jìn)行計(jì)算：

其中：C為樣品中硫氰酸鈉的含量，mg/L；C0為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的待測濾液中硫氰酸鈉的含量，mg/L；V1為取樣量，mL；V2為樣品最終體積，mL；f為稀釋倍數(shù)，液態(tài)樣品f=1，固態(tài)樣品f=10。

2 分析與討論

2.1 沉淀劑的加入量

實(shí)驗(yàn)分別加入不同量的三氯乙酸溶液對樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行沉淀、離心（9000rad/min，3min）和過濾，然后將濾液靜置一段時(shí)間觀察沉淀效果，結(jié)果見表1，最終選擇樣品與沉淀劑的比例為30︰20進(jìn)行前處理。

2.2 檢測波長的確定

取16mg/L的硫氰酸鈉基質(zhì)加標(biāo)溶液，顯色后在400～700nm可見光區(qū)進(jìn)行光譜掃描（見圖1），在此區(qū)域內(nèi)溶液于波長450nm處有1個(gè)最大吸收峰，此時(shí)樣品的吸光度值最大，響應(yīng)最靈敏，且該波長前后吸收曲線斜率較小，故選擇450nm作為檢測波長。

2.3 顯色劑及反應(yīng)時(shí)間的確定

硫氰酸鈉能與Fe3+反應(yīng)生成硫氰酸鐵紅色絡(luò)合物。實(shí)驗(yàn)初期考慮使用FeCl3溶液作為顯色劑，但其顯色不穩(wěn)定且本底顏色較深，影響結(jié)果的準(zhǔn)確測定；而Fe（NO3）3溶液中加入少量的濃硝酸后可抑制Fe3+的水解，本底顏色淺，可作為顯色劑使用，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其用量對顯色效果有明顯影響。

由圖2可以看出，取4mL 20mg/L硫氰酸鈉基質(zhì)加標(biāo)溶液進(jìn)行顯色反應(yīng)，反應(yīng)液吸光值隨Fe（NO3）3加入量的增大而增大，當(dāng)加入量為2mL時(shí)，曲線斜率較大，之后趨于平緩。實(shí)驗(yàn)選定濾液與顯色劑的用量為4︰2并進(jìn)行顯色穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。

由表2可得，隨著反應(yīng)時(shí)間的推移，至反應(yīng)后1h內(nèi)，不同濃度的硫氰酸鈉基質(zhì)加標(biāo)溶液吸光值（OD值）變化不大，根據(jù)實(shí)際操作情況，本實(shí)驗(yàn)選定顯色反應(yīng)時(shí)間為10min。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線底液的選擇

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)牛奶底液成分對測定結(jié)果的影響較大，分別用純水、三氯乙酸溶液、空白奶樣（反應(yīng)液凈吸光度值與試劑空白最接近的樣品，經(jīng)離子色譜法測定未檢出NaSCN）濾液作為底液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測得的硫氰酸鈉加標(biāo)回收率如表3所示，最終選擇空白奶樣濾液作為本底構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3 結(jié)果與驗(yàn)證

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按1.2.4的步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以硫氰酸鈉基質(zhì)加標(biāo)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的凈吸光度值為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示，得到回歸方程y=0.021x+0.021，相關(guān)系數(shù)R2=0.9997?？梢?，硫氰酸鈉濃度為0～16mg/L范圍內(nèi)，其質(zhì)量濃度與吸光度線性關(guān)系良好。

3.2 檢出限與回收率實(shí)驗(yàn)

按上述方法進(jìn)行20次空白溶液測量，得到標(biāo)準(zhǔn)偏差S=0.0005，分別以3倍、10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差除以工作曲線斜率計(jì)得方法最低檢出限為0.07mg/L，最低定量限為0.25mg/L。

為驗(yàn)證曲線可靠性，任意選取一種奶樣進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。分別吸取硫氰酸鈉標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.015、0.03、0.06、0.18、0.30、1.20mL，加入液體奶樣至60mL，充分混勻后吸取15mL按上述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)標(biāo)樣平行測定3次，取平均值計(jì)算回收率，結(jié)果見表4。實(shí)驗(yàn)測得回收率在95.24%～101.19%之間，準(zhǔn)確度較高。

3.3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

任意選取生乳、原料乳粉、純牛奶和調(diào)制乳樣品各一個(gè)，按上述方法進(jìn)行處理，平行測定6次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。由表5可見，重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.16%～2.38%之間，本方法對原料乳及乳制品中硫氰酸鈉含量的測定重現(xiàn)性良好。

3.4 與離子色譜法的比較

取各類牛奶樣品6個(gè)，分別用離子色譜法和紫外分光光度法測定硫氰酸鈉含量，檢測結(jié)果如表6所示。對兩組數(shù)據(jù)作t檢驗(yàn)，t=0.3614 總結(jié)

實(shí)驗(yàn)測得各大牧場生乳樣品中硫氰酸鈉的含量在0.25～5mg/L之間，檢出率較高但含量較低，可排除人為添加的可能，系屬于奶牛防御體系天然存在的硫氰酸鹽。本法具有操作簡捷、成本低、靈敏度較高、重現(xiàn)性好、回收率高的特點(diǎn)，與離子色譜法測得結(jié)果之間無顯著性差異，適用于生鮮乳、原料乳粉及加工后的乳制品中硫氰酸鈉的快速測定。

參考文獻(xiàn)

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