牛奶中慶大霉素膠體金試紙條檢測方法的研究

彭桂平鄧紅枚劉 平李 楠魯曉雄聶雯瑩*

牛奶中慶大霉素膠體金試紙條檢測方法的研究

彭桂平①鄧紅枚①劉 平②③李 楠②③魯曉雄②③聶雯瑩*②③

（①湖南省桂陽縣畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)局 424400 ②北京勤邦生物技術(shù)有限公司③北京市食品安全免疫快速檢測工程技術(shù)研究中心）

采用膠體金免疫層析法檢測牛奶中慶大霉素殘留。制備得到了慶大霉素半抗原，并與載體蛋白偶聯(lián)得到免疫原和包被原，用免疫原制備特異性單克隆抗體，建立了一種簡單、快速和高通量的檢測牛奶中慶大霉素殘留量的膠體金免疫層析法。試紙條對牛奶樣品的檢測限為20μg/L，假陽性率為0，假陰性率為0，重復(fù)性較好，牛奶樣品可直接檢測，檢測時間只需5min，適合在基層抽檢、乳品企業(yè)質(zhì)控、原料奶站現(xiàn)場大量篩查使用。

慶大霉素 膠體金免疫層析 快速檢測試紙條 牛奶

慶大霉素（Gentamicin， GM）是由放線菌科小單孢子屬產(chǎn)生的氨基糖苷類抗生素［1］，對多種革蘭氏陽性菌和陰性菌都具有顯著的抗菌效果，作為飼料添加劑和治療疾病的抗生素廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)。使用方法主要是添加慶大霉素混合于飼料中使用，或采用直接注入患病乳牛乳房治療奶牛乳房炎，兩種給藥方式都會造成藥物在牛乳中殘留。慶大霉素對人類具有明顯的毒害作用，對腦神經(jīng)、聽覺以及腎臟的損害嚴(yán)重［2-3］。許多國家和國際組織均明確規(guī)定了食品中該藥物殘留的最大殘留限量。歐盟規(guī)定，牛奶中的最大殘留量為100μg/kg。農(nóng)業(yè)部235號公告規(guī)定了慶大霉素在牛奶中的最大殘留限量為200μg/kg。目前，慶大霉素的檢測方法主要有微生物法［4］，儀器分析法［5-6］，免疫分析法［7-9］。微生物法檢測時間長；儀器分析法樣品前處理復(fù)雜、檢測時間長、儀器昂貴，適用于樣品在實(shí)驗(yàn)室中的分析檢測；免疫分析法具有靈敏、快速、檢測成本低等特點(diǎn)。本研究建立了牛奶中慶大霉素膠體金試紙條檢測方法，方法靈敏度高、操作簡單、檢測快速、不需要儀器設(shè)備，適合在基層抽檢、乳品企業(yè)質(zhì)控、原料奶站現(xiàn)場大量篩查使用。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

牛奶樣品購自超市；慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Sigma公司；結(jié)合物釋放墊、PVC背板購自上海金標(biāo)生物科技有限公司；硝酸纖維素膜、吸收墊、樣品墊購自普利來基因技術(shù)公司；慶大霉素抗原、慶大霉素單克隆抗體均為自制；羊抗鼠IgG抗體購自Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2儀器

1.3方法

1.3.1慶大霉素半抗原合成 取1.0g慶大霉素加入到N，N-二甲基甲酰胺中溶解，再加入0.8g重鉻酸吡啶，攪拌，加入0.3ml乙酸，60℃油浴加熱攪拌6h，待反應(yīng)完全，停止反應(yīng)并蒸干，加水和乙酸乙酯萃取，干燥，乙醇重結(jié)晶，得到產(chǎn)物1.取產(chǎn)物1加甲醇溶解，再加0.3gK2CO3，攪拌，向其中加入0.4g甲酸苯肼，在室溫下攪拌8h，待有沉淀物析出離心分離，用乙醇洗滌，再加乙酸乙酯重結(jié)晶，得到慶大霉素半抗原。合成路線如圖1所示：

圖1　慶大霉素半抗原合成路線

1.3.2免疫原的制備 取20mg慶大霉素半抗原，溶解于1mlN，N-二甲基甲酰胺中，取25mg二氯乙烷和N-羥基琥珀酰亞胺用0.1ml水充分溶解后加入半抗原溶解液中，室溫下攪拌24h，即可得到反應(yīng)液A；稱取牛血清白蛋白（BSA）50mg，使之充分溶解在pH7.2、3.8ml的磷酸鹽緩沖液中，將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到HRP溶液中，并于室溫下攪拌24h；用0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液于4℃透析3天，每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)，得到慶大霉素免疫原；分裝，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3包被原的制備 將50mg BSA溶液替換為40ml卵清白蛋白（OVA），其余方法同1.3.2。

1.3.4單克隆抗體的制備 將免疫原分別注入到6-8周齡BALB/C磁性小鼠Balb/c小鼠體內(nèi)，首免時將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射，間隔兩周取相同劑量免疫原加弗氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫1次，免疫劑量為150μg/只，使其產(chǎn)生抗血清。第三次免疫后一周眶下竇采血，然后按照常規(guī)方法分離血清；以未免疫的小鼠血清為陰性對照；間接競爭ELISA方法測定抗體效價及抑制情況，選取血清效價高及特性好的小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫，72h后做融合。取免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞，按9：1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競爭ELISA測定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法進(jìn)行克隆，分別得到分泌苯乙醇胺A單克隆抗體的苯乙醇胺A單克隆雜交瘤細(xì)胞株。將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，7天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞5×105個/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行純化，提純后即可得到單克隆抗體。

1.3.5慶大霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備 膠體金溶液100ml，用0.2mol/L K2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液pH值至7.2，按每毫升膠體金溶液中加入15μg抗體量的標(biāo)準(zhǔn)向膠體金溶液中加入慶大霉素單克隆抗體，攪拌30min，加入10%牛血清白蛋白使其在膠體金溶液中的終濃度為1%，靜置30min，12000r/min，4℃離心30min，棄上清液，沉淀用復(fù)溶緩沖液（BSA0.4%（體積百分含量）、吐溫-80 0.1%（質(zhì)量百分含量）、pH值為7.2的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS））洗滌兩次，用10ml的復(fù)溶緩沖液將沉淀重懸，放置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6慶大霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的凍干 加入50μl慶大霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，放入冷凍干燥機(jī)中，在冷阱溫度為-50℃條件下，速凍4h后，再真空干燥，取出，即得到凍干的慶大霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，密封保存，金標(biāo)抗體的凍干量為1μg/ml。

至于綜合材料藝術(shù)在中國的狀況，值得一提的是1985年11月18日，中國美術(shù)館舉辦的美國藝術(shù)家羅伯特.勞申伯格(Robert Rauschenberg)個人藝術(shù)展。這個展覽對中國藝術(shù)家的影響極大，很多藝術(shù)家由此開始接觸綜合材料在藝術(shù)中的運(yùn)用，各種沖破學(xué)院風(fēng)格的作品紛紛出現(xiàn)。雖然是一種邊緣化的野蠻生長，卻具有十足的生命力。

1.3.7樣品吸收墊的制備 樣品吸收墊置于含0.5%（體積百分含量）BSA、pH為7.2的0.1mol/L的PBS中浸泡3min，烘干備用。

1.3.8慶大霉素包被原和羊抗鼠抗抗體的包被 用pH為7.2的0.01mol/L PBS將慶大霉素抗原稀釋至濃度為1.5mg/L，用噴膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的檢測線T線上；用pH為7.2、0.01mol/L PBS將羊抗鼠抗抗體稀釋，用噴膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的質(zhì)控線C線上，包被量為1.2μl/cm。將包被好的反應(yīng)膜置于37℃下干燥2h，備用。

圖2　慶大霉素殘留檢測試紙條平面結(jié)構(gòu)圖

1.3.9試紙條組裝 將樣品吸收墊1、反應(yīng)膜2、吸水墊3和保護(hù)膜7依次按順序黏貼在PVC底板6上；樣品吸收墊的末端與反應(yīng)膜的始端相連接，反應(yīng)膜的末端與吸水墊的始端相連接，樣品吸收墊的始端與底板的始端對齊，吸水墊的末端與底板的末端對齊；在組裝好的試紙條樣品吸收墊上黏貼保護(hù)膜，保護(hù)膜上印有MAX標(biāo)記線。

2　結(jié)果與分析

2.1慶大霉素半抗原的鑒定

慶大霉素是小分子藥物，沒有免疫原性，不能刺激機(jī)體產(chǎn)生針對慶大霉素抗原的特異性抗體［10］，慶大霉素半抗原是用重鉻酸吡啶將慶大霉素原藥中的醇羥基氧化成酮基，得到單酮基慶大霉素，然后單酮基慶大霉素與對甲酸苯肼進(jìn)行縮合反應(yīng)，得到帶有羧基的慶大霉素半抗原產(chǎn)物。再與載體蛋白偶聯(lián)，得到免疫原。在免疫動物時，使免疫原的決定簇盡可能暴露在動物免疫系統(tǒng)中，從而提高抗體的靈敏度和特異性。

2.2慶大霉素免疫原和包被原的鑒定

通過紫外掃描法鑒定慶大霉素半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)是否成功。用純水稀釋慶大霉素半抗原、BSA、OVA和兩種蛋白與慶大霉素的結(jié)合物，用紫外分光光度計進(jìn)行全波長掃描，得到紫外吸收光譜圖。如圖4～8所示。

圖4　慶大霉素半抗原紫外光譜鑒定圖

圖5　牛血清白蛋白紫外光譜鑒定圖

圖6　卵清白蛋白的紫外光譜鑒定圖

圖7　慶大霉素半抗原-牛血清白蛋白偶聯(lián)物紫外光譜鑒定圖

圖8　慶大霉素半抗原-卵清白蛋白偶聯(lián)物的紫外光譜鑒定圖

根據(jù)公式K=A/CL分別計算出慶大霉素、BSA、OVA的摩爾消光系數(shù)。在載體蛋白和慶大霉素半抗原的最大波長處檢測偶聯(lián)物的吸光度值，按公式計算兩種物質(zhì)在偶聯(lián)物中的摩爾濃度比，即偶聯(lián)比：Ca/Cb=（A偶264×KBSA280-A偶280×KBSA264）/（A偶280×KGM 264-A偶264×KGM 280）。蛋白含量的測定：將偶聯(lián)物稀釋到適當(dāng)倍數(shù)后，測定280nm和260nm的分光光度值，按公式計算蛋白的濃度即偶聯(lián)物的濃度：蛋白質(zhì)（mg/ml）=1.45×OD280-0.74×OD260。根據(jù)慶大霉素半抗原、載體蛋白、偶聯(lián)物在特定波長下的摩爾吸光系數(shù)估算半抗原與載體蛋白的結(jié)合比分別為13：1和15：1；免疫原的蛋白含量為9.6mg/ml，包被原的蛋白含量為7.4mg/ml，偶聯(lián)效果較好。

2.3慶大霉素包被原和羊抗鼠抗抗體最適包被濃度

慶大霉素包被原和羊抗鼠抗抗體用0.02mol/L pH7.2的PBS分別配制濃度為0.2、0.5、1.0、1.5、2.0mg/ml和0.05、0.1、0.2、0.4、0.6mg/ml，用噴膜儀將上述濃度的慶大霉素包被原和羊抗鼠抗抗體包被于硝酸纖維素膜上，分別制備得到檢測線T線和C線，并于金標(biāo)抗體裝配成試紙條，取空白牛奶樣品用試紙條進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果如表1。結(jié)果顯示，采用1mg/ml的慶大霉素包被原和0.2mg/ml的羊抗鼠抗抗體的濃度即可滿足靈敏度要求。增加羊抗鼠抗抗體的濃度不提高檢測靈敏度。

表1　陰性牛奶樣品慶大霉素包被原和羊抗鼠抗抗體不同包被濃度的檢測結(jié)果 （mg/ml）

2.4金標(biāo)抗體的最適標(biāo)記濃度

將慶大霉素單克隆抗體用pH7.4、0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液逐級稀釋為5～40μg/ml，各取0.1ml按順序加入一系列裝有1ml膠體金的試管中，5min后在上述試管內(nèi)分別加入0.1ml、10％氯化鈉溶液，混勻，靜置2h后觀察結(jié)果，結(jié)果見表2，圖4。

表2　膠體金標(biāo)記抗體最適量的測定 （ml、μg）

1～4管由于加入的抗體蛋白量不足，為達(dá)到穩(wěn)定膠體金的最適抗體量，均呈現(xiàn)出由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象，從第5管開始膠體金溶液顏色基本一致，如圖9所示，當(dāng)抗體量達(dá)到一定數(shù)值后，對應(yīng)的吸光光度值的變化趨于穩(wěn)定，這是由于加入的抗體量達(dá)到或超過了穩(wěn)定膠體金的最適抗體量所致。通過圖9可知，當(dāng)抗體量等于和大于15μg/ml時，對應(yīng)的吸光光度值的變化趨于穩(wěn)定，故慶大霉素單克隆抗體最適用量15μg/ml。

圖9　膠體金與標(biāo)記蛋白比例試驗(yàn)結(jié)果

2.5試紙條檢測限的確定

向空白牛奶樣品中添加慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品至終濃度分別為10μg/L、20μg/L和40μg/L，用試紙條進(jìn)行檢測，每個樣品進(jìn)行5次重復(fù)，5min后觀察結(jié)果，驗(yàn)證試紙條的最低檢測限，根據(jù)圖5判定結(jié)果。當(dāng)牛奶樣品中慶大霉素濃度為10μg/L時，試紙條T線和C線均顯色，檢測結(jié)果為陰性（-）；當(dāng)牛奶中慶大霉素的添加濃度為20μg/L和40μg/L時，試紙條T線不顯色，C線顯色，檢測結(jié)果為陽性（+），可以得出試紙條的檢測限為20μg/L。結(jié)果如表3所示。

表3　慶大霉素殘留檢測試紙條檢測限的測定

2.6重復(fù)性的測定

取試紙條檢測陰性牛奶樣品和慶大霉素濃度為20μg/L的陽性牛奶樣品各5份，每個樣品重復(fù)測定5次，觀察檢測結(jié)果確定試紙條重復(fù)性。試紙條檢測結(jié)果顯示，對慶大霉素陰性樣品檢測，結(jié)果均為陰性，對陽性樣品檢測，結(jié)果均為陽性。試紙條檢測未出現(xiàn)錯誤結(jié)果，因此試紙條的假陽性率為0，假陰性率為0，試紙條的重復(fù)性較好。

2.7特異性的測定

表4　不同濃度藥物間的交叉反應(yīng)和特異性

將慶大霉素、鏈霉素、雙氫鏈霉素、新霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶于pH7.1、0.01mol/L的磷酸鹽緩沖溶液中，至終濃度分別為0、20、40、100、200μg/L，用試紙條檢測，結(jié)果見表4。表中結(jié)果顯示慶大霉素與上述藥物之間均無交叉反應(yīng)，特異性強(qiáng)。

3　結(jié)論

慶大霉素半抗原合成，是用重鉻酸吡啶將慶大霉素原藥中的醇羥基氧化成酮基，得到單酮基慶大霉素，然后單酮基慶大霉素與對甲酸苯肼進(jìn)行縮合反應(yīng)，得到帶有羧基的慶大霉素半抗原產(chǎn)物，使得抗原決定簇盡可能暴露于動物的免疫系統(tǒng)中，提高了制備高靈敏度慶大霉素特異性抗體的可能性；利用紫外分光光度法測定慶大霉素半抗原、免疫原和包被原的吸光度值，計算偶聯(lián)比和蛋白含量，可知偶聯(lián)效果較好；通過對慶大霉素包被原質(zhì)量濃度和羊抗鼠抗抗體質(zhì)量濃度的篩選，得到1mg/ml的慶大霉素包被原和0.2mg/ml的羊抗鼠抗抗體的濃度即可滿足靈敏度要求；慶大霉素單克隆抗體最適用量15μg/ml；試紙條的檢測限為20μg/L；試紙條的假陽性率為0，假陰性率為0，重復(fù)性較好；試紙條對慶大霉素具有較強(qiáng)的特異性。本研究建立的牛奶中慶大霉素試紙條檢測方法適合在基層抽檢、乳品企業(yè)質(zhì)控、原料奶站現(xiàn)場大量篩查使用。

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S859.79+6

A

1007-1733（2015）06-0003-04

國家科技支撐計劃課題（2012BAF14B02）