血凝抑制實驗中常出現(xiàn)的誤差及解決辦法

李旭蓉，李 珊

（張掖市動物疫病預防控制中心，甘肅 張掖734000）

近年來，為了加強動物疫情監(jiān)測工作，及時掌握疫情動態(tài)和免疫效果，有效地防止疫情發(fā)生和傳播。張掖市禽流感春秋兩季和日常監(jiān)測免疫抗體工作量也逐年增加，血凝和血凝抑制試驗是目前實驗室檢測禽流感中最常用的方法，此方法在實驗中雖然操作簡單，判定結果方便，卻很容易因為操用不規(guī)范，技術不正確而影響試驗結果的準確性。筆者對影響試驗結果準確性的因素進行了簡單分析討論，以供同行參考。

1 抗原的標定

禽流感血凝抑制試驗中必須對抗原進行標定，這是非常重要的環(huán)節(jié)。通常所用的抗原為H5亞型（Re-4或Re-6株）抗原，同一批號的抗原同時標定兩瓶以上，最好用110°V 型板進行標定，重復做幾板，以防每板4排結果的準確性和一致性，以減少誤差。HA 標定滴度過高或過低都會HI結果。過高，HI滴度偏低；過低，HI滴度偏高，甚至很高。配成4HAU 抗原后，為防止抗原配制不準確，可作抗原回歸試驗，若有2孔凝集，則視為抗原配制準確，如果抗原回歸試驗不成立，則需要調(diào)整4HAU 抗原的濃度，至抗原回歸試驗成立為止。

2 紅細胞的配制

由于雞的個體差異，紅細胞對病毒的敏感性也不同從而影響HI效價，一般需要3 只以上非免疫公雞提供的紅細胞混合在一起，可以減少自凝現(xiàn)象的干擾。有抗體雞提供的紅細胞需要多洗滌幾次，以減少血液中抗體對試驗結果的影響。洗滌時要去除表面的白細胞膜，洗好的紅細胞濃度應在0.5%～1%間最為合適，經(jīng)過多次實踐0.75%比較合適，濃度為1%時沉降的血點過大，濃度為0.5%時，沉降的血點太小，不易判斷，而且沉降速度慢。過高或過低都會影響HI滴度的準確測定。有的雞紅血球沉降慢，靜置30 min 仍不能沉降下來。因此，配制好的紅細胞，一定要先觀察血沉質(zhì)量，不合格的不能使用。

3 稀釋液（PBS）的配制

稀釋液的pH 為7.0～7.2時紅細胞沉淀最充分，圖形也最清晰。稀釋液的pH 在5.8以下，紅細胞易自凝；pH 為7.8 以上凝集的紅細胞易洗脫加快。pH7.2的稀釋液要121 ℃滅菌15min后4 ℃保存?zhèn)溆?，配制好稀釋液時間不易過長，否則，會污染，出現(xiàn)試驗不成立或跳孔等現(xiàn)象。如果用生理鹽水代替PBS液，最好使用新開瓶的滅菌生理鹽水，配制稀釋液時要注意結晶水的問題。

4 時間和溫度

時間溫度對實驗結果也有影響，要求室內(nèi)溫度在20～25℃進行實驗，室內(nèi)溫度不適宜的應置于恒溫箱內(nèi)。因為溫度低于4℃時紅細胞有時會發(fā)生自凝現(xiàn)象，且反應速度慢，高于37℃時，凝集的紅細胞易洗脫，紅細胞沉降很快，導致試驗不成立，抗原與抗體作用時間應在規(guī)定的時間及時觀察，過短出現(xiàn)凝集不完全。過長出現(xiàn)洗脫現(xiàn)象，超過10 min，紅細胞發(fā)生裂解，結果不再有意義。

5 血清稀釋的混合程度

稀釋血清時，如果混合不均勻，結果會出現(xiàn)差異，因此稀釋時要來回吹打10次以上。在稀釋前先要按下移液器再插入反應板的每一孔孔底，來回吹打時手不要完全按下放開，在一個小的范圍內(nèi)吹打，最后慢慢放開手吸取后插入第二孔液面以下，這樣孔內(nèi)和吸頭內(nèi)不易產(chǎn)生氣泡，且稀釋充分。在反復抽取過程中，移液器吸頭不要離開液面，防止產(chǎn)生氣泡和液體濺出孔面，造成移液體積不準確。影響檢測結果的準確性。另外，連續(xù)加樣時要用倒吸法。

6 V 型微量反應板

反應板的質(zhì)量和清潔度對凝集反應有著不可忽視的影響，必須使用反應板透明度好及凹孔干凈，孔內(nèi)壁光滑透明，板面水平，不能彎曲、傾斜。試驗中應采用90°V 型或者110°V 型微量反應板，如用不同角度V 型微量反應板混用和陳舊反應板，對實驗結果的準確性也產(chǎn)生一定的影響。

7 HI的判定方法

試驗時要做紅細胞對照、陽性血清對照和陰性血清對照。一般來說，陽性血清對照的時間相對長些，在紅血球完全沉降的前后5min內(nèi)判定試驗結果較好，判斷結果時，將微量反應板傾斜45度，孔底沉定的紅細胞流動性好，呈淚珠樣流淌，邊緣無凝集顆粒的為凝集抑制。

總之在進行禽流感血凝抑制試驗時應綜合考慮各方面因素，制定一個標準化操作方法以免對結果判斷產(chǎn)生誤差，只有把試驗標準化才能正確評價疫苗免疫存在的意義。也只有在標準化評判過程中才能做出正確的結論。