免疫膠體金技術(shù)及其在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用

黃巖 王逃生 王秀杰 王方明

(1.新鄉(xiāng)市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所,453000；2.衛(wèi)輝市畜牧局，453100)

1857 年，法拉第制備出了膠體金，在其中加入電解質(zhì)后，膠體金由紅色變?yōu)樗{(lán)色，最終成為無色，而加入其它分子便能夠阻止這種變化。1971年，膠體金被應(yīng)用到了免疫化學(xué)中，此后它在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中開始廣泛應(yīng)用。

1 膠體金的制備及免疫膠體金檢測技術(shù)

1.1 膠體金的制備

在氯金酸水溶液中加入還原劑使其還原并凝結(jié)成膠體金粒子，這就是膠體金。還原劑的不同能夠使其粒子的大小和數(shù)量也不同；還原劑濃度越高，粒子的數(shù)量就越多，體積就越小。制備膠體金的方法較多，如抗壞血酸還原法、檸檬酸還原法等。不同的制備方法能夠制備出直徑1nm～500nm的粒子。常用的免疫標(biāo)記膠體金粒子的直接在3nm～50nm之間。

1.2 免疫膠體金技術(shù)的原理

免疫膠體金技術(shù)即利用膠體金標(biāo)記抗原抗體。膠體金的顆粒之間的狀態(tài)較為穩(wěn)定，標(biāo)記過程就是將蛋白質(zhì)分子吸附到膠體金表面的過程，因?yàn)槟z體金顆粒所帶的負(fù)電荷，而蛋白質(zhì)所帶的是正電荷，正負(fù)相吸，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)牢固的依附關(guān)系。利用還原法能夠?qū)⒙冉疬€原成不同直徑的粒子，它能夠與毒素、酶、抗生素等結(jié)合，在檢驗(yàn)檢疫中有重要的作用。在顯微鏡下觀察免疫金顆粒與蛋白結(jié)合物時(shí)，它呈現(xiàn)出黑褐色，是一種定性或定量的免疫檢測方法。

1.3 免疫膠體金檢測技術(shù)

目前，常用的免疫膠體金檢測技術(shù)有CGEIA和DIGFA兩種，它們都是以將待驗(yàn)標(biāo)本加入抗原或抗體中，經(jīng)過毛細(xì)管作用或滲濾作用后使兩者結(jié)合，然后再通過膠體金進(jìn)行標(biāo)記。第一種，DIGFA。這種技術(shù)利用了微孔濾膜吸附蛋白質(zhì)的特性，通過滲濾、膠體金標(biāo)記等過程能夠抗原或抗體與膜上的抗原或抗體結(jié)合，同時(shí)也能夠提高免疫反應(yīng)的速度，使膠體金的顯色速度加快。第二中，CGEIA。免疫層析條由玻璃纖維膜、金標(biāo)墊、硝酸纖維膜、纖維膜組成，將它們按照由下向上的順序粘貼在支持物上，切成條就能用于檢測。在檢測時(shí)，將其插入待檢液中，等待5分鐘就能夠觀察結(jié)果。檢測原理為：當(dāng)檢測條插入檢液中，液體中的抗原從底部被吸收與金標(biāo)探針發(fā)生反應(yīng)，形成復(fù)合物，然后再通過毛細(xì)作用被運(yùn)送到硝酸纖維膜上，再發(fā)生反應(yīng)形成新的檢驗(yàn)區(qū)。該方法方便快捷、敏感性好，能夠直接觀察結(jié)果，應(yīng)用廣發(fā)。

2 免疫膠體金技術(shù)在獸醫(yī)臨床中的應(yīng)用

2.1 在禽病的診斷方面的應(yīng)用

我國養(yǎng)禽業(yè)的規(guī)模大，禽病的危害也比較嚴(yán)重。預(yù)防禽病要弄清致病因子，免疫膠體金技術(shù)以其快速、簡便、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)逐漸成為了禽病診斷的重要方法。王愛華選取了直徑為15nm的膠體金制備出了雞減蛋綜合征病毒實(shí)驗(yàn)條，檢驗(yàn)效果較好；王澤霖利用膠體金標(biāo)記了純化的羊抗鼠IgG，建立出了一種對(duì)雞傳染性支氣管炎病毒檢測技術(shù)。

2.2 在犬病毒診斷方面的應(yīng)用

徐葛林采用了檸檬酸三鈉還原法制備了膠體金顆粒，用來標(biāo)記狂犬病病毒單抗，制成了免疫層析試紙，結(jié)果顯示，該紙條只與狂犬病病毒抗原有反應(yīng)，與其他的均無反應(yīng)，同時(shí)比較了近50份的可疑狂犬病唾液，負(fù)荷率較高。

2.3 在家畜疫病診斷方面的應(yīng)用

鄭鳴使用的雙抗原夾心法建立了豬瘟病抗體的檢測紙條，該方法方便、靈敏度高、區(qū)別度高，適合豬瘟的診斷。李恪梅用布魯菌純蛋白衍化物制作抗原，能夠檢測人和動(dòng)物血液中的抗布魯菌抗體。

3 免疫膠體金技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展

目前，我國所使用的快速實(shí)驗(yàn)的成品多來自于國外，國內(nèi)的研究水平還比較低。由于免疫膠體金的市場潛力巨大，要努力完善制作工藝，研制出我們自己的檢測產(chǎn)品。

3.1 提高檢測的靈敏度

一些實(shí)驗(yàn)的靈敏度能夠達(dá)到1ng/mL，但還有一些試驗(yàn)不能達(dá)到這一水平。靈敏度的高低直接影響了膠體金技術(shù)的使用范圍和使用效果。因此，可以利用信號(hào)放大系統(tǒng)、鏈親和素與生物素結(jié)合等能夠顯著提高檢測的靈敏度。

3.2 實(shí)施多元化檢測

多元化檢測即利用多種反應(yīng)物測定，測定結(jié)果多元化，這種方法多使用在聯(lián)檢中，如乙型肝炎表面抗原、丙型肝炎抗體等以及巨細(xì)病毒、風(fēng)疹病毒等抗體的檢測等。

3.3 實(shí)施定量檢測

使用免疫膠體金進(jìn)行檢測時(shí)，如果標(biāo)本中的受檢物的濃度不在試劑敏感度的范圍內(nèi)時(shí)為陽性反應(yīng)，這種方法多用于檢測正常體液中不存在的或含量極低但發(fā)生疾病時(shí)明顯升高的物質(zhì)。因此，必須考慮此種情況的存在，要考慮試劑原料和制作工藝是否科學(xué)合理，否則即使受檢物相同在各分試劑中也能顯示出不同的顏色。因此，要努力實(shí)現(xiàn)定量檢測，提高檢測的精確度。

4 結(jié)語

目前，獸醫(yī)臨床檢測方法仍以血清檢測法為主，它耗時(shí)長、步驟繁多，適用性較低。免疫膠體金技術(shù)以方便快捷、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)受到了廣泛的關(guān)注和應(yīng)用，逐漸在獸醫(yī)的疾病診斷和疫病檢疫中顯示出了獨(dú)特的價(jià)值。隨著各種標(biāo)記方法的發(fā)展，免疫膠體金技術(shù)也進(jìn)一步提高靈敏度，努力實(shí)現(xiàn)多元化檢測，努力提高在獸醫(yī)臨床方面有高的應(yīng)用價(jià)值。

[1]劉春龍,李忠秋.免疫膠體金法和免疫單擴(kuò)散法檢測牛初乳中IgG含量的比較研究[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).2006(04).

[2]鄭鳴,金彥法,閆國慶.利用膠體金免疫層析法檢測豬瘟強(qiáng)、弱毒抗體方法的建立[J].鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào).2006(02).

[3]汪琳,周琦,賴平安,張鶴曉.免疫膠體金技術(shù)及其在檢驗(yàn)檢疫中的應(yīng)用[J].檢驗(yàn)檢疫科學(xué).2004(04).