豬重組IL-2、IL-4和IFN-γ對口蹄疫合成肽疫苗的免疫增強作用研究

涂 浩，趙星燦，楊占娜，李夢輝，徐立新，嚴若峰，宋小凱，李祥瑞*

(1.南京農業(yè)大學動物醫(yī)學院，南京 210095；2.洛陽市動物疫病控制中心，洛陽 471002)

豬重組IL-2、IL-4和IFN-γ對口蹄疫合成肽疫苗的免疫增強作用研究

涂 浩1，趙星燦2，楊占娜1，李夢輝1，徐立新1，嚴若峰1，宋小凱1，李祥瑞1*

(1.南京農業(yè)大學動物醫(yī)學院，南京 210095；2.洛陽市動物疫病控制中心，洛陽 471002)

為了研究豬IL-2、IL-4和IFN-γ對口蹄疫合成肽疫苗的免疫佐劑效應，將經(jīng)測定具有生物學活性的豬重組IL-2、IL-4和IFN-γ與口蹄疫合成肽疫苗配伍免疫仔豬，檢測仔豬抗口蹄疫抗體水平和血清細胞因子IL-4、IL-10、IL-17和IFN-γ含量的變化，觀察其免疫佐劑效應。結果表明：制備的IL-2、IL-4和IFN-γ重組蛋白質均有較好的生物學活性，其中IL-2和IFN-γ重組蛋白質均能極顯著提高仔豬抗口蹄疫抗體水平(P<0.01)，而IL-4重組蛋白質抑制口蹄疫抗體的產(chǎn)生(P<0.01)。血清細胞因子檢測結果發(fā)現(xiàn)口蹄疫疫苗+IL-4組的IL-4和IL-10含量均較空白疫苗免疫豬顯著升高(P<0.05)，口蹄疫疫苗+IL-2組及口蹄疫疫苗+IFN-γ組的IFN-γ含量較空白疫苗免疫豬極顯著升高(P<0.01)。結果提示，重組細胞因子IL-2和IFN-γ分別作為免疫佐劑與口蹄疫疫苗聯(lián)用，能顯著增強機體的體液和細胞免疫應答。

重組蛋白質；IL-2；IL-4；IFN-γ；佐劑效應；口蹄疫

免疫接種常是控制傳染病的重要手段，然而傳統(tǒng)的疫苗接種存在多種安全問題，新型的亞單位疫苗、合成肽疫苗、核酸疫苗等存在反應性弱、免疫原性小，在體內易降解等缺點，使得機體難以產(chǎn)生有效的免疫保護力。因此免疫佐劑就成為當今研究熱點之一。細胞因子是機體內免疫細胞或免疫相關細胞產(chǎn)生的一類具有廣泛生物學活性的蛋白質類物質，在機體的體液免疫和細胞免疫產(chǎn)生和調節(jié)過程中都發(fā)揮重要作用，是機體執(zhí)行免疫學功能不可缺少的成分[1]，相比傳統(tǒng)佐劑，作為免疫增強劑具有更多優(yōu)勢。

白細胞介素2(interleukin-2，IL-2)、白細胞介素4(interleukin-4，IL-4)和干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)都是機體免疫調節(jié)不可缺少的細胞因子，具有很高的研究價值[2]。IL-2能同時增強細胞免疫和體液免疫，是一種天然的免疫增強劑和治療劑[3-5]；IFN-γ可增加抗原遞呈細胞的主要組織相容性復合物(MHC)分子的表達，對產(chǎn)生CTL應答和提高IgG抗體水平有很大幫助[6-7]；IL-2和IFN-γ均屬于TH1型細胞因子，可顯著地協(xié)同促進CD8+T細胞的增殖[8]；IL-4主要增強TH2反應，有研究表明豬IL-4不同于鼠和人的IL-4，其不能誘導和刺激B細胞的分泌和生長，且抑制抗體的產(chǎn)生，同時抑制抗原刺激的B細胞增殖[9]。目前關于豬的重組細胞因子對豬口蹄疫疫苗的免疫增強作用研究較少，為了明確IL-2、IL-4和IFN-γ的免疫增強作用，進而開發(fā)新型、安全、高效的疫苗佐劑，本試驗通過表達IL-2、IL-4和IFN-γ基因的重組蛋白質作為疫苗的免疫佐劑，在實驗動物上開展了這三種重組蛋白質對豬口蹄疫合成肽疫苗免疫增強作用的研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

21日齡健康仔豬30頭(口蹄疫抗體檢測陰性)，體重6.0 kg±0.5 kg，來自河南洛陽某豬場，品種包括長白、大白、杜洛克等。

1.2 試劑

口蹄疫O型液相阻斷ELISA抗體檢測試劑盒購自中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所(批號：2014031901)；口蹄疫合成肽疫苗(批號：20131109)，由河南洛陽市畜牧工作站提供；細胞因子IL-4(貨號：CSB-E06785p)、IL-10(貨號：CSB-E06779p)、IL-17(貨號：CSB-E08057p)、IFN-γ(貨號：CSB-E06794p)檢測試劑盒購自武漢華美生物技術有限公司；RMPI1640(貨號：C11875500BT)、DMEM(貨號：C11320500BT)細胞培養(yǎng)液購自Life公司；外周血淋巴細胞分離液(貨號：LTS1077)購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司；刀豆蛋白ConA(貨號：SLBD7276V)購自Sigma公司；Cell Counting Kit-8(編號：C0038)購自碧云天生物技術研究所；Easy Protein Quantitative Kit(貨號：DQ101-01H10403G008)購自北京全式金生物技術有限公司；豬IL-2、IL-4和IFN-γ基因的重組表達質粒pET28a-IL-2、pET32a-IL-4和pET28a-IFN-γ由本實驗室構建；水皰性口炎病毒(VSV)由本實驗室保存。

1.3 細胞因子重組蛋白質的誘導表達

將構建的重組原核表達菌pET28a-IL-2、pET32a-IL-4和pET28a-IFN-γ分別接種至含有相應抗生素的LB培養(yǎng)液中，37 ℃培養(yǎng)過夜，然后各按1∶100接種量轉接于500 mL LB培養(yǎng)液中，37 ℃振蕩搖菌至OD600 nm值達0.4～0.6時，加入終濃度為0.1 mmol·L-1的IPTG，37 ℃誘導培養(yǎng)5 h，離心收集菌體，用STE緩沖液洗滌2次，再收集菌體，經(jīng)超聲波裂解，離心分離上清和包涵體。上述重組蛋白質主要以包涵體形式存在，收集沉淀，用8 mol·L-1尿素溶解。

1.4 細胞因子重組蛋白質的純化和復性

將8 mol·L-1尿素溶解的包涵體離心收集上清，用0.22 μm濾膜過濾除菌。按照如下步驟純化重組蛋白質：先用10 mL雙蒸水清洗1 mL His-Trap純化柱，接著用10 mL的包涵體Binding Buffer(0.02 mol·L-1Na2HPO4、0.02 mol·L-1NaH2PO4、0.5 mol·L-1NaCl、0.02 mol·L-1咪唑、8 mol·L-1尿素)平衡純化柱，再將蛋白質樣品過His-Trap純化柱，用10 mL包涵體Binding Buffer洗去雜蛋白質，最后用5 mL的Elution Buffer(0.02 mol·L-1Na2HPO4、0.02 mol·L-1NaH2PO4、0.5 mol·L-1NaCl、0.5 mol·L-1咪唑、8 mol·L-1尿素)洗脫蛋白質樣品。將收集的蛋白質樣品進行SDS-PAGE電泳觀察純化情況。

采用透析復性法，將純化后的重組蛋白質轉移到透析袋中，依次在含有6、4、3、2、0 mol·L-1尿素復性緩沖液(0.02 mol·L-1Tris-Cl、0.5 mol·L-1NaCl、1 mmol·L-1GSH、0.1 mmol·L-1GSSG)中4 ℃條件下各透析12 h，后用無K+PBS中透析2次。最后經(jīng)聚乙二醇(PEG20000)包埋濃縮至適當體積，過濾除菌后置-70 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 細胞因子重組蛋白質濃度測定及生物活性分析

1.5.1 重組IL-2、IL-4、IFN-γ蛋白質濃度測定 復性后的重組蛋白質濃度使用Easy Protein Quantitative Kit試劑盒，采用Bradford法[10]嚴格按照說明書進行測定。

1.5.2 重組IL-2、IL-4蛋白質生物活性測定 無菌采取豬外周靜脈血，3.8%檸檬酸鈉抗凝，用淋巴細胞分離液分離PBMC[11]。用RMPI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、青霉素100 U·mL-1和鏈霉素100 μg·mL-1)調節(jié)細胞濃度為1×106個·mL-1，兩塊96孔板每孔加細胞懸浮液100 μL，依次分別加入豬IL-2和IL-4蛋白質，使其終質量濃度為5、10、20、40 μg·mL-1，每個梯度做5個重復，同時設細胞對照組、調零孔、空載體對照組和ConA對照組， 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)孵育2 h。用酶標儀測定450 nm的OD值，計算細胞增殖指數(shù)。增殖指數(shù)(SI)=試驗組OD450 nm值/細胞對照組OD450 nm值。

1.5.3 重組IFN-γ蛋白質生物活性測定 在96 孔細胞培養(yǎng)板上用DMEM+10%FBS+1%雙抗培養(yǎng)液培養(yǎng)PK15細胞長成單層，吸棄培養(yǎng)液，分別接種100 μL用DMEM 培養(yǎng)液10倍梯度遞次稀釋的豬水皰性口炎病毒(VSV)，每個稀釋梯度重復8孔，同時作陰性對照，置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察細胞病變(CPE)，連續(xù)3 d，然后按Reed-Muench法[12]計算VSV的TCID50。

測定濃度的可溶性重組IFN-γ蛋白質用DMEM+2%FBS培養(yǎng)液作10倍稀釋，再進行2倍遞次稀釋，按每孔0.1 mL的量加入PK15細胞長成單層的96孔培養(yǎng)板上，每個稀釋度重復8孔，37 ℃、5%的CO2條件誘導培養(yǎng)24 h后吸棄培養(yǎng)液，用100 TCID50的VSV攻毒，同時設細胞對照和病毒對照，繼續(xù)培養(yǎng)并觀察CPE，連續(xù)3 d。參照病毒毒價測定法，用病變抑制孔代替毒價的病變孔，按Reed-Muench法計算IFN-γ蛋白質抗病毒活性單位。

1.6 重組細胞因子對口蹄疫疫苗免疫增強作用研究

試驗選取3周齡健康仔豬30頭，隨機分成6組，每組5頭。設空白對照組(PBS)、口蹄疫疫苗組(Vaccine)、口蹄疫疫苗+IL-2組(Vaccine+IL-2)、口蹄疫疫苗+IL-4組(Vaccine+IL-4)、口蹄疫疫苗+IFN-γ組(Vaccine+IFN-γ)和口蹄疫疫苗+空載體組(Vaccine+pET28a/32a空載體蛋白質)。試驗組在仔豬耳根后肌肉注射O型口蹄疫合成肽疫苗的同時，按照15 μg·kg-1劑量注射重組蛋白質。于免疫后第0、14 、30 、60 、90 天豬頸部前腔靜脈采血分離血清，進行O型口蹄疫抗體ELISA檢測和細胞因子IL-4、IL-10、IL-17、IFN-γ的檢測。

1.7 統(tǒng)計處理

應用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 細胞因子重組蛋白質的表達、分布純化及復性

SDS-PAGE 電泳結果(圖1)顯示，攜帶pET28a-IL-2、pET32a-IL-4和pET28a-IFN-γ重組質粒的陽性克隆菌經(jīng)IPTG誘導后，分別表達了相對分子質量約為21.4、30.3和20.7 ku的目的蛋白質，與預期的蛋白質相對分子質量大小一致。蛋白質的可溶性分析表明，三種重組蛋白質均呈不可溶表達，在菌體內主要以不溶性的包涵體形式存在，用鎳離子親和層析法對其進行純化后電泳，出現(xiàn)較清晰單一的特異性條帶。

2.2 細胞因子重組蛋白質質量濃度測定和生物活性分析

2.2.1 重組蛋白質質量濃度測定 采用Bradford法測定復性濃縮后的可溶性重組蛋白質，根據(jù)試劑盒中BSA標準品繪制標準曲線，計算得到重組IL-2蛋白質質量濃度為0.675 mg·mL-1，IL-4蛋白質質量濃度為0.751 mg·mL-1，IFN-γ蛋白質質量濃度為0.205 mg·mL-1。

2.2.2 重組IL-2、IL-4蛋白質生物活性測定 由表1可知，重組蛋白質IL-2在體外能刺激豬外周血淋巴細胞的增殖，并且增殖效果與蛋白質劑量有一定關系，在適宜蛋白質質量濃度條件下，隨蛋白質質量濃度增大，增殖效應逐漸增強，在蛋白質質量濃度為10 μg·mL-1時，增殖效果最明顯。

M.蛋白質相對分子質量標準；1.表達的IL-2包涵體蛋白；2.純化的IL-2包涵體蛋白；3.復性后IL-2包涵體蛋白；4.表達的IL-4包涵體蛋白；5.純化的IL-4包涵體蛋白；6.復性后IL-4包涵體蛋白；7.表達的IFN-γ包涵體蛋白；8.純化的IFN-γ包涵體蛋白；9.復性后IFN-γ包涵體蛋白M.Protein marker；1.The sediment of IL-2；2.Purified IL-2 protein；3.Renatured IL-2 protein；4.The sediment of IL-4；5.Purified IL-4 protein；6.Renatured IL-4 protein；7.The sediment of IFN-γ；8.Purified IFN-γ protein；9.Renatured IFN-γ protein圖1 IL-2、IL-4和IFN-γ表達產(chǎn)物沉淀純化復性SDS-PAGE電泳分析Fig.1 Expressed IL-2，IL-4 and IFN-γ products sediment purification and renaturation analysis by SDS-PAGE

表1 重組蛋白質IL-2對豬外周血淋巴細胞增殖效應

Table1 Effect of recombinant protein IL-2 on proliferation of lymphocyte

組別GroupOD450nmOD450nmvalue增殖指數(shù)(SI)Proliferationindex(SI)細胞對照0．2977±0．0064—5μg·mL-1IL?20．3437±0．0022??1．154510μg·mL-1IL?20．4288±0．0130??1．440420μg·mL-1IL?20．4008±0．0088??1．346340μg·mL-1IL?20．3462±0．0050??1．1629pET28a空載體蛋白質0．3020±0．00931．0144ConA單獨刺激0．5650±0．0033??1．89791640培養(yǎng)液0．0000±0．0000—

*表示與細胞對照組比較差異顯著(P<0.05)；**表示與細胞對照組比較差異極顯著(P<0.01)。下表同

* indicateP<0.05 between the experimental group and cell control group，respectively；** indicateP<0.01 between the experimental group and cell control group，respectively.The same as below

由表2可知，雖然重組蛋白質IL-4刺激豬外周血淋巴細胞增殖試驗中，當IL-4終質量濃度為10和20 μg·mL-1時差異顯著，但增殖指數(shù)變化很小。

2.2.3 重組IFN-γ蛋白質生物活性測定 逐日觀察10倍梯度稀釋的VSV在96孔細胞培養(yǎng)板上致細胞病變結果，如表3所示，可知病毒株的TCID50在10-6(70%)和10-7(18.2%)之間，根據(jù)Reed-Muench公式計算得VSV在PK15細胞中的TCID50為10-6.38·0.1 mL-1。而10倍稀釋后再2倍遞次稀釋的重組豬IFN-γ蛋白質在PK15細胞上抑制水皰性口炎病毒復制的結果見表4，參照病毒毒價計算法計算IFN-γ活性為(64.71-50)/(64.71-37.5)=54.06%，其在PK15細胞上抗VSV活性為(10×24.540 6/0.1 mL)/0.205 mg·mL-1=1.135×104U·mg-1。

表2 重組蛋白質IL-4對豬外周血淋巴細胞增殖效應

Table2 Effect of recombinant protein IL-4 on proliferation of lymphocyte

組別GroupOD450nmOD450nmvalue增殖指數(shù)(SI)Proliferationindex(SI)細胞對照0．2522±0．0072—5μg·mL-1IL?40．2562±0．00301．015910μg·mL-1IL?40．2678±0．0049??1．061920μg·mL-1IL?40．2598±0．0050?1．030140μg·mL-1IL?40．2491±0．00290．9877pET32a空載體蛋白質0．2550±0．00821．0111ConA單獨刺激0．5235±0．0078??2．07571640培養(yǎng)液0．0000±0．0000—

表3 VSV致細胞病變結果

Table 3 Cytopathic effect caused by VSV

表4 重組蛋白質IFN-γ抗VSV活性測定

Table 4 Recombinant protein IFN-γ inhibited cytopathogenic effect in VSV

IFN?γ稀釋度DilutionofIFN?γ(10×)接種細胞孔數(shù)Numberofinoculation出現(xiàn)CPE孔WellswithCPE不出現(xiàn)CPE孔WellswithoutCPE累計總數(shù)Total有CPE孔WellswithCPE無CPE孔WellswithoutCPE細胞孔總數(shù)Totalwells細胞病變保護率/%CPErestrainrate2180803232100228171242596238263172085248356111764．71258441061637．50268621621811．112788024024028880320320攻毒對照8808080陰性對照808088100

2.3 重組細胞因子對口蹄疫抗體水平的增強效果

采用口蹄疫O型液相阻斷ELISA抗體檢測試劑盒檢測重組蛋白質IL-2、IL-4、IFN-γ的免疫增強作用。結果如圖2所示，可知免疫后第0—30天，各疫苗免疫組O型口蹄疫抗體水平有明顯的上升，其中第14—30天，IL-2組、IFN-γ組與疫苗對照組、空載體蛋白質組相比，差異極顯著(P<0.01)，且IL-2組抗體上升水平略高于IFN-γ組；而IL-4組在免疫后第30天的檢測結果顯示其不僅不能促進抗體的產(chǎn)生，反而抑制其產(chǎn)生(P<0.01)；空載體蛋白質組與疫苗對照組相比，抗體水平差異不顯著(P>0.05)。在免疫后第30天，各免疫組的口蹄疫抗體水平開始下降，但IL-2組的抗體下降水平低于空載體蛋白質組與疫苗對照組。

試驗組與同一時間疫苗對照組之間，*.P<0.05；**.P<0.01。下圖同Between the experimental group and the vaccine control group at the same time，*.P<0.05；**.P<0.01.The same as below圖2 不同免疫組抗O型FMD抗體滴度變化Fig.2 Changes of antibody titers against serotype O in different groups after immunization

2.4 細胞因子重組蛋白質對仔豬血清細胞因子含量變化的影響

2.4.1 細胞因子重組蛋白質對仔豬血清細胞因子IL-4含量變化的影響 免疫仔豬血清IL-4的檢測結果如圖3A所示，仔豬免疫后第14、30天，各免疫組與免疫前相比，均檢測到IL-4水平的上升，且差異極顯著(P<0.01)，免疫前各組IL-4含量差異不顯著(P>0.05)。免疫后第14天檢測結果表明，IL-4組的IL-4水平顯著高于疫苗對照組(P<0.05)，而其余各免疫組與疫苗對照組相比，差異不顯著(P>0.05)。免疫后第30天，IL-2組與疫苗對照組相比，IL-4濃度降低，差異顯著(P<0.05)；IFN-γ組與疫苗對照組相比，IL-4水平也降低，且差異極顯著(P<0.01)。

2.4.2 細胞因子重組蛋白質對仔豬血清細胞因子IL-10含量變化的影響 免疫仔豬血清IL-10的檢測結果如圖3B所示，仔豬免疫后第14天，各免疫組與免疫前相比，均檢測到IL-10水平的上升，在第14天時濃度達到最高值，隨后濃度開始降低，且差異顯著(P<0.05)，免疫后第30天，疫苗組、IL-4組與免疫前相比差異顯著，而IL-2組、IFN-γ組、空載體蛋白質組與免疫前相比差異不顯著(P>0.05)，且免疫第0天各組IL-10水平差異不顯著。免疫后第14天檢測結果表明，各免疫組間IL-10含量差異不顯著(P>0.05)。免疫后第30天，僅IL-4組的IL-10含量顯著高于疫苗對照組(P<0.05)。

2.4.3 細胞因子重組蛋白質對仔豬血清細胞因子IL-17含量變化的影響 免疫仔豬血清IL-17的檢測結果如圖3C所示，仔豬免疫后第14、30天，各免疫組與免疫前相比，IL-17含量差異不顯著(P>0.05)，各免疫組IL-2、IL-4及空載體蛋白質組與疫苗對照組相比差異不顯著(P>0.05)，僅IFN-γ組在第30天檢測結果與疫苗對照組相比，差異顯著(P<0.05)。由圖可看到IL-4組及IFN-γ組在第30天檢測到IL-17濃度的降低。

2.4.4 細胞因子重組蛋白質對仔豬血清細胞因子IFN-γ含量變化的影響 免疫仔豬血清IFN-γ的檢測結果如圖3D所示，仔豬免疫后第14、30天，各免疫組與免疫前相比，均檢測到血清IFN-γ水平的上升，且差異極顯著(P<0.01)，免疫第0天，各組之間IFN-γ含量差異不顯著(P>0.05)。免疫后第14天的檢測結果表明，各免疫組IL-2、IL-4、IFN-γ與疫苗對照組相比，IFN-γ含量差異不顯著(P>0.05)。免疫后第30天，IL-2組及IFN-γ組的IFN-γ水平均極顯著高于疫苗對照組(P<0.01)，而IL-4組及空載體蛋白質組與疫苗對照組相比，IFN-γ含量差異不顯著(P>0.05)。

3 討 論

細胞因子是動物體內特異高效調控免疫細胞和協(xié)調免疫應答最重要的信號分子，具有較強的免疫佐劑效應，既可增強抗原的免疫原性，又可作用于體內免疫細胞，促進其增殖、分化，加強其活性與功能，影響細胞內生物活性分子的表達與分泌。在本試驗中，將經(jīng)鑒定具有良好生物學活性的豬重組IL-2、IL-4和IFN-γ與口蹄疫疫苗聯(lián)合免疫仔豬，結果表明重組細胞因子IL-2和IFN-γ能顯著促進機體的免疫應答，增強口蹄疫抗體的產(chǎn)生，而IL-4不僅不能促進口蹄疫抗體產(chǎn)生，反而抑制機體的體液免疫應答。

圖3 試驗仔豬免疫后血清細胞因子含量變化Fig.3 Change of the content of cytokines in the sera of experimental pigs after vaccination

IL-2是重要的免疫調節(jié)因子，具有多種免疫調節(jié)作用，可以活化NK細胞、巨噬細胞，促進T細胞增殖分化和分泌細胞因子，促進B細胞增殖和分泌抗體[13-14]，增強機體的細胞免疫和體液免疫功能。T細胞可分成兩大亞群：即CD4+T細胞和CD8+T細胞。TH細胞是CD4+T細胞的一個重要亞群，在IL-2、IFN-γ等微環(huán)境中向TH1細胞分化，TH1細胞分泌的細胞因子如IL-2等可提供進行性信號，引起B(yǎng)細胞增殖、分化，形成漿細胞和記憶性B細胞，發(fā)生類轉換，并分泌抗體[2]。H.T.Wong等[15]發(fā)現(xiàn)IL-2可增強機體對FMDV感染的免疫應答；Y.Lin等[16]發(fā)現(xiàn)豬IL-2重組蛋白質與偽狂犬病毒疫苗聯(lián)用可以顯著增強抗體的產(chǎn)生和CTL細胞活性；G.Rompato等[17]用IL-2質粒與PRRSV疫苗共同免疫豬時發(fā)現(xiàn)其可明顯增強機體對PRRSV感染的細胞免疫和體液免疫的功能。CCK-8試劑盒檢測結果證明本實驗室制備的豬重組IL-2蛋白質具有良好的生物學活性，能顯著刺激豬外周血淋巴細胞增殖。而重組蛋白質對FMDV抗體水平增強效果的結果也表明IL-2蛋白質能促進機體B細胞增殖和抗體生成，提高對疫苗的應答能力，與上述研究結果一致。在進行細胞因子檢測時發(fā)現(xiàn)，IL-2組的IFN-γ含量相對高于疫苗對照組，而IL-4、IL-10含量相對降低，可能是因為IL-2可誘導TH細胞發(fā)生TH1型極化反應，促使TH1細胞分泌IL-2和IFN-γ，IL-2和IFN-γ可通過上調MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ類分子及黏膜分子的表達，促進CTL活化可產(chǎn)生大量IFN-γ，后者也可通過APC分泌IL-2。

IL-4是1982年發(fā)現(xiàn)的具有多種生物學活性的細胞因子，主要由活化的T細胞、單核細胞分泌，肥大細胞和嗜堿性粒細胞也可合成分泌。IL-4在調節(jié)T、B淋巴細胞的分化、活化，促進以TH2細胞為特征的免疫應答過程中發(fā)揮重要作用?，F(xiàn)有研究表明，豬IL-4不同于鼠和人的IL-4，不但不能誘導和刺激B細胞的增殖，而且抑制抗體的產(chǎn)生和IL-6的分泌[9,18]；G.Rompato等[17]也發(fā)現(xiàn)用IL-4質粒與PRRSV DNA疫苗聯(lián)用時發(fā)現(xiàn)豬IL-4不能促進機體對PRRSV感染的應答，反而抑制機體抗體的產(chǎn)生。IL-4、TNF、lipopolysaccharide(LPS)等均能誘導豬IL-4的合成[19]。本試驗中用CCK-8試劑盒檢測IL-4促豬淋巴細胞增殖差異顯著可能是由于豬IL-4不能刺激T細胞增殖，但能誘導細胞的生長且呈現(xiàn)劑量依賴性關系，而對于B細胞可能是豬IL-4不能傳遞增殖信號卻遞呈了生存信號，能夠短暫刺激細胞的分裂[9]。本試驗的疫苗佐劑效應結果與上述報道一致，發(fā)現(xiàn)豬IL-4重組蛋白質與口蹄疫疫苗共同免疫豬后不能促進機體免疫應答和抗體產(chǎn)生。目前，對于IL-4抑制免疫應答的機制仍不明確，有報道闡釋是IL-4作用于樹突狀細胞(DC)的基部而減弱溶細胞性T細胞的應答，IL-4阻止抗原刺激白細胞毒性前體物質促樹突細胞分化的過程，從而影響DC對CD8+T細胞的活化。該調節(jié)的分子基礎DC表面的B7-1/B7-2，研究發(fā)現(xiàn)B7-2能誘使CD8+T細胞擴增，B7-1控制其溶細胞活性的獲得[20]；也有猜想認為豬IL-13有與其他種屬動物IL-4相似的功能[21]，這兩基因位于同一染色體上，而且鼠IL-4基因的轉錄因子結合部位與豬IL-13基因轉錄因子結合部位相似，鼠IL-13基因的轉錄因子結合部位與豬IL-4基因轉錄因子結合部位相似[9]。

IFN-γ是一種具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調節(jié)作用的細胞因子，主要由活化的T細胞和NK細胞產(chǎn)生，在機體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，其生物學效應具有高度的種屬特異性。IFN-γ是體內重要的免疫調節(jié)因子，以上調MHC分子的表達，促進抗原遞呈為最主要的免疫調節(jié)活性，增強APC與T細胞相互作用；還可通過增強巨噬細胞表面表達Fc受體，有利于對抗原的吞噬，K、NK細胞對靶細胞的殺傷以及T、B淋巴細胞的激活，增強機體免疫應答能力；IFN-γ不僅是TH1分泌的效應因子，而且對TH1/ TH2分化具有重要調節(jié)作用，可以促使CD4+TH細胞向TH1細胞的極化，并刺激IL-2、IL-12、TNF-α等細胞因子的上調，起到免疫系統(tǒng)活化的效果[22]。因此，IFN-γ成為新型免疫佐劑中的研究熱點。G.M.Liu等[6]研究發(fā)現(xiàn)用構建的重組質粒PCV2-ORF2-IFN-γ免疫小鼠后可促進機體PCV2-ORF2特異性抗體的產(chǎn)生；Y.P.Wang等[23]也發(fā)現(xiàn)IFN-γ質粒與PCV2-Cap 蛋白質共免疫可增強機體的抗體水平和淋巴細胞的增殖；A.Summerfield等[24]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MDV對干擾素很敏感，IFN-α對動物機體和細胞的FMDV有明顯的抑制效應，IFN-γ能活化NK細胞和巨噬細胞，阻止病毒復制；M.P.Moraes等[25]和S.M.Kim等[26]也先后證實Ⅰ型和Ⅱ型干擾素的協(xié)同使用能抑制FMDV的復制，增強機體對FMDV感染的免疫應答。本試驗中IFN-γ重組蛋白質抗VSV活性結果表明制備的IFN-γ蛋白質具有較強的抗病毒作用，其主要是通過誘導一些目的基因的表達來實現(xiàn)的，這些目的基因表達產(chǎn)物主要是一些參與病毒RNA降解和剪切的酶或蛋白質。IFN-γ對口蹄疫疫苗免疫增強效果的結果也與上述報道一致，說明IFN-γ可特異性地增強機體免疫應答，使機體獲得有效的保護。細胞因子檢測結果發(fā)現(xiàn)IFN-γ組IL-17含量的下降可能是由于IFN-γ可以干擾TGF-β1誘導的TH17細胞分化過程[27]，同時檢測到IL-4含量的下降可能是由于干擾素通過抑制STAT6活性來減少IL-4基因表達[28]。

細胞因子是重要的免疫調節(jié)分子，各種細胞借助于自己分泌的細胞因子實現(xiàn)各自的功能，細胞因子水平的高低，可以直接或間接反映免疫細胞或免疫應答狀態(tài)[29]。然而，靜息期細胞通常不表達細胞因子，細胞因子的產(chǎn)生，有賴于抗原的刺激，刺激消失，細胞因子的分泌也逐漸停止，其作用也逐步減弱[30]。本研究中，分別于免疫后第14、30天檢測細胞因子水平，目的是為了觀察免疫應答狀態(tài)。結果發(fā)現(xiàn)，免疫后第14天和30天細胞因子水平依然較高，說明疫苗抗原在動物體內存在時間較長，能夠在較長時間內誘導免疫應答。

4 結 論

豬重組細胞因子IL-2和IFN-γ作為免疫佐劑與口蹄疫疫苗聯(lián)合免疫后能夠顯著加強機體的體液免疫和細胞免疫應答，這為研究新型高效安全的免疫增強劑提供了依據(jù)，而對IL-4抑制機體抗體產(chǎn)生的機制還需進一步研究。

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(編輯 白永平)

Immunological Enhancement of Recombinant Porcine IL-2，IL-4 and IFN-γ on Foot-and-mouth Disease Synthetic Peptide Vaccine

TU Hao1，ZHAO Xing-can2，YANG Zhan-na1，LI Meng-hui1，XU Li-xin1， YAN Ruo-feng1，SONG Xiao-kai1，LI Xiang-rui1*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing210095，China； 2.CenterforAnimalDiseaseControlandPreventionofLuoyangCity，Luoyang471002，China)

The current study was undertaken to certify the immunological adjuvant effect of recombinant IL-2，IL-4 and IFN-γ of porcine on the foot-and-mouth disease synthetic peptide vaccine.The changes of antibody and IL-4，IL-10，IL-17 and IFN-γ levels of porcines injected with synthetic peptide vaccine against foot-and-mouth disease and recombinant IL-2，IL-4 and IFN-γ of porcine，respectively.The results showed that the recombinant protein we made all had good biological activity.IL-2 and IFN-γ protein significantly increased the level of antibody against foot-and-mouth disease (P<0.01)，while IL-4 appeared to have a suppressive effect (P<0.01).Recombinant IL-4 significantly enhanced IL-4 and IL-10 secretions compared with that of the vaccine control group (P<0.05).The IL-2 and IFN-γ could significantly stimulate the production of IFN-γ (P<0.01).These results indicated that IL-2 and IFN-γ of porcine could significantly enhance the immune response against FMDV respectively.

recombinant protein；IL-2；IL-4；IFN-γ；adjuvant effect；foot-and-mouth disease

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.08.015

2014-11-17

十二五“863”計劃(2011AA10A211)家畜口蹄疫新型疫苗研制與生產(chǎn)工藝創(chuàng)新子課題偶蹄動物用新型免疫佐劑創(chuàng)新與產(chǎn)業(yè)化和江蘇省優(yōu)勢學科項目(PAPD)資助

涂 浩(1990-)，男，安徽舒城人，碩士，主要從事動物細胞因子克隆與應用研究，E-mail：2012107053@njau.edu.cn

*通信作者：李祥瑞，教授，博士生導師，主要從事寄生蟲分子與免疫、動物細胞因子的基因克隆與應用和獸醫(yī)公共衛(wèi)生研究，Tel：025-84399000，E-mail：lixiangrui@njau.edu.cn

S858.285.3

A

0366-6964(2015)08-1390-10