基于GC-MS策略的奶牛熱應(yīng)激血液代謝組學(xué)研究

郭延生,賈啟鵬,陶金忠

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)系，銀川 730020)

基于GC-MS策略的奶牛熱應(yīng)激血液代謝組學(xué)研究

郭延生,賈啟鵬,陶金忠*

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)系，銀川 730020)

為了系統(tǒng)揭示熱應(yīng)激對(duì)奶牛血液代謝物及其代謝通路的影響。本研究根據(jù)奶牛熱應(yīng)激的判定標(biāo)準(zhǔn)，選擇10頭處于熱應(yīng)激狀態(tài)的荷斯坦高產(chǎn)泌乳牛為熱應(yīng)激組，至次日凌晨直腸溫度和呼吸頻率恢復(fù)到正常范圍時(shí)，再次被視為恢復(fù)組。各組奶牛尾靜脈采血，制備血漿。然后采用GC-MS代謝組學(xué)技術(shù)，結(jié)合模式識(shí)別策略尋找兩組奶牛血液差異代謝物，并將差異代謝物輸入KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行代謝通路的構(gòu)建與功能分析。結(jié)果表明，8個(gè)內(nèi)源性代謝物可作為奶牛熱應(yīng)激的潛在生物標(biāo)志物。其中，葡萄糖、α-亞麻酸、亞油酸、甘油、棕櫚酸、β-羥丁酸和甘氨膽酸鹽含量在熱應(yīng)激過(guò)程中顯著降低，而乳酸含量顯著升高。提示熱應(yīng)激加劇了奶牛能量負(fù)平衡狀態(tài)，主要通過(guò)增強(qiáng)脂肪酸氧化和甘油分解代謝途徑活性，抑制糖酵解過(guò)程進(jìn)行調(diào)節(jié)和應(yīng)答，在此過(guò)程中伴有肝功能障礙的生理現(xiàn)象。研究結(jié)果可為進(jìn)一步闡明奶牛熱應(yīng)激的生理機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

熱應(yīng)激；奶牛；代謝組學(xué)；GC-MS；血液代謝物

奶牛熱應(yīng)激是指奶牛受到超過(guò)本身體溫調(diào)節(jié)能力的過(guò)高溫度刺激時(shí),引起機(jī)體發(fā)生的一系列異常反應(yīng)。為了適應(yīng)熱應(yīng)激，奶牛開(kāi)始動(dòng)用物理、生化和生理過(guò)程進(jìn)行調(diào)節(jié)，以維持熱平衡和正常體溫。高產(chǎn)泌乳牛處于能量負(fù)平衡狀態(tài)，而熱應(yīng)激時(shí)奶牛為了降低體內(nèi)代謝熱，本能的減少干物質(zhì)采食量[1-2]，進(jìn)一步加劇了高產(chǎn)泌乳牛的能量負(fù)平衡[3]。大量研究表明，熱應(yīng)激時(shí)奶牛產(chǎn)奶量和繁殖性能顯著降低與其血液代謝物變化和能量負(fù)平衡密切相關(guān)[4-9]。因此檢測(cè)血液內(nèi)源性小分子物質(zhì)代謝輪廓的變化有助于進(jìn)一步揭示熱應(yīng)激引起奶牛泌乳性能和繁殖性能下降的生理機(jī)制。但目前研究?jī)H局限于對(duì)血液中某些有限的生理指標(biāo)的檢測(cè)，并且這些生理指標(biāo)來(lái)自不同的試驗(yàn)和報(bào)道，缺乏整體系統(tǒng)的檢測(cè)方法研究熱應(yīng)激奶牛血液生理指標(biāo)的代謝輪廓。代謝組學(xué)技術(shù)已應(yīng)用于多種疾病生物標(biāo)志物的挖掘和篩選中，它以生物體內(nèi)小分子物質(zhì)的動(dòng)態(tài)規(guī)律變化來(lái)表征生物體的生理病理變化趨勢(shì)，最終通過(guò)還原相關(guān)聯(lián)生物事件提示生物體的病理生理變化實(shí)質(zhì)和機(jī)制所在，其高通量的特性可以使體內(nèi)同時(shí)出現(xiàn)的多個(gè)生理指標(biāo)相互關(guān)聯(lián)起來(lái)。

本研究采用GC-MS代謝組學(xué)技術(shù)，結(jié)合模式識(shí)別方法研究熱應(yīng)激對(duì)泌乳奶牛血液內(nèi)源性代謝物的變化，以進(jìn)一步闡明奶牛熱應(yīng)激的生理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

美國(guó)安捷倫 6890N/5973N型GC-MS氣質(zhì)聯(lián)用儀，梅特勒AL104電子分析天平，美國(guó)BECKMAN 公司OPTIME L-80 低溫高速離心機(jī) 。

吡啶、乙腈、二十二烷、正庚烷等均為分析純(北京北化康泰臨床試劑有限公司)；甲氧胺鹽酸鹽、N-甲基-三甲基硅烷-三氟乙酰胺(MSTFA)：三甲基-氯硅烷(TMCS) =100∶1(瑞士 Fluka公司)。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物和樣品采集

試驗(yàn)?zāi)膛?lái)自寧夏某私人養(yǎng)殖場(chǎng)，在當(dāng)?shù)貧夂蜃钛谉岬脑路?8月)，連續(xù)檢測(cè)該場(chǎng)的圈舍溫度和濕度，以濕溫指數(shù)作為評(píng)價(jià)該場(chǎng)奶牛是否出現(xiàn)熱應(yīng)激的條件。根據(jù)奶牛熱應(yīng)激的判定標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)圈舍濕度指數(shù)大于72時(shí)，奶牛處于熱應(yīng)激狀態(tài)。據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)10頭2～3胎，泌乳60～90 d的荷斯坦高產(chǎn)泌乳母牛被選為熱應(yīng)激組，檢查試驗(yàn)牛直腸溫度均高于39 ℃，呼吸頻率在90～120 次·min-1。用含肝素的采血管于尾靜脈采血，3 000 r·min-1，4 ℃離心分離10 min制備血漿，編號(hào)1～10，于-80 ℃冰箱保存。次日06：00上述奶牛直腸溫度和呼吸頻率恢復(fù)到正常范圍，被再次視為恢復(fù)組采集血樣，用同樣方法制備血漿并保存，編號(hào)11～20。

1.3 血漿樣品的衍生化

將血漿樣品從-80 ℃取出，在室溫條件下解凍，取其解凍后的樣品100 μL放入離心管中，加入乙腈250 μL以除去蛋白；在冰浴冷卻的條件下超聲10 min，4 ℃離心機(jī)中以10 000 r·min-1離心分離10 min，離心后的樣品取其上清液于1.5 mL離心管中；將上清液放入40 ℃條件下的真空干燥箱中使其揮發(fā)至干；取出干燥的離心管，加入15 mg·mL-1甲氧胺吡啶溶液50 μL使其充分混勻，再在70 ℃條件下肟化1 h，加入MSTFA：TMCS=100∶1硅烷化試劑50 μL，進(jìn)行衍生化處理，充分混勻后靜置1 h，而后加入含有二十二烷的正庚烷(內(nèi)標(biāo)，0.1 mg·mL-1)150 μL，使其充分混勻，于4 ℃ 10 000 r·min-1離心10 min[10]，然后移取全部上清液于微量進(jìn)樣管中，以備GC-MS分析。

1.4 GC-MS分析

GC-MS分析條件：進(jìn)樣量1 μL，初始溫度為85 ℃，保持5 min，程序升溫以10 ℃·min-1的速度上升至280 ℃，保持10 min；進(jìn)樣口溫度：270 ℃；接口溫度：270 ℃；離子源(EI)溫度：230 ℃；電離電壓：70 eV；四極桿溫度：150 ℃；載氣(高純氦氣)：流速1.0 mL·min-1；掃描方式：全掃描60～600 m·z-1。色譜柱：OV-1701[11]。

1.5 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析

從Aglient 6890N/5973N 型GC-MS氣質(zhì)聯(lián)用儀 Chemstation 采集的信號(hào)和質(zhì)譜數(shù)據(jù)以ASCII的文件的格式(*.csv)輸出，導(dǎo)出的原始數(shù)據(jù)采用Matlab7.0軟件對(duì)每一個(gè)峰進(jìn)行校準(zhǔn)并積分，積分后峰匹配后得到峰表，峰表由化學(xué)成分的保留時(shí)間和相應(yīng)的峰面積組成。用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算不同組樣品的峰組成的相對(duì)含量。得到變量的峰表。此峰表包括了一些缺失值，根據(jù)S.Bijlsma等[12]報(bào)道的缺失值處理方法，采用修正80%的原則來(lái)去除缺失值，即去除某一組中出現(xiàn)頻率低于80%的代謝物，得到一個(gè)由代謝物的相對(duì)峰面積和保留時(shí)間組成的二維數(shù)據(jù)矩陣。此矩陣被導(dǎo)入SIMCA-P 12.0軟件(瑞典Umetrics AB公司)中的主成分分析法(PCA)和偏最小二乘法判別分析法(PLS-DA)進(jìn)行模式識(shí)別分析，篩選差異代謝物，作為奶牛熱應(yīng)激的潛在生物標(biāo)志物。

1.6 生物標(biāo)志物的鑒定及代謝通路分析

根據(jù)生物標(biāo)志物的質(zhì)譜碎片(RI)，主要通過(guò)比較儀器自帶的美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)局化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(National Institute of Standards and Technology，NIST)圖書(shū)館物中的質(zhì)譜信息，進(jìn)行生物標(biāo)志物的鑒定和推測(cè)。如果質(zhì)譜碎片在NIST圖書(shū)館中不匹配，再將RI與 Metabolome Database (http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/gmd.html)和Metabolome 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.hmdb.ca/) 進(jìn)行比較，最終確定其結(jié)構(gòu)。為進(jìn)一步識(shí)別和可視化熱應(yīng)激對(duì)奶牛血液代謝途徑的影響，將鑒定后的生物標(biāo)志物輸入KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.kegg.com)，選擇Bostaurus(cow通路)為通路路徑庫(kù)，進(jìn)行代謝通路的構(gòu)建與分析。

2 結(jié) 果

2.1 奶牛血液代謝物的GC-MS分析

按1.4方法建立了熱應(yīng)激奶牛血液GC-MS指紋圖譜，其總離子流圖見(jiàn)圖1。導(dǎo)出的原始數(shù)據(jù)采用Matlab7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理后得到一個(gè)20樣本×95變量的峰表，此表是由相對(duì)峰面積和保留時(shí)間組成的二位數(shù)據(jù)矩陣。

1～20.血漿編號(hào)：1～10.熱應(yīng)激組；11～20.恢復(fù)組1-20.The plasm sample code：1-10.Heat stress dairy cows；11-20.Recovery dairy cows圖1 奶牛血漿GC-MS總離子流圖Fig.1 Total ion current (TIC) chromatograms for the GC-MS metabonomic analysis in dairy cows plasma

2.2 模式識(shí)別和差異代謝物的篩選

將所得二位數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA-P 12.0軟件進(jìn)行模式識(shí)別，首先采用非監(jiān)督類(lèi)的模式識(shí)別方法PCA對(duì)奶牛血液 GC-MS代謝指紋峰的內(nèi)在相似性進(jìn)行識(shí)別，在PCA得分圖中，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)獨(dú)立的樣品。從圖2A可以看出，血液樣品7和10位于95%置信區(qū)間外，從數(shù)據(jù)矩陣中發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)樣品的內(nèi)標(biāo)峰面積極顯著低于其他樣品的峰面積，推測(cè)可能由于樣品衍生化過(guò)程中的試驗(yàn)誤差所致。過(guò)低的內(nèi)標(biāo)峰面積會(huì)影響相對(duì)峰面積的值。因此樣品7和10被排除后進(jìn)一步進(jìn)行PCA分析，新的PCA散點(diǎn)圖(圖2B)顯示剩余的18個(gè)樣品均在95%置信區(qū)間。

在PCA模型基礎(chǔ)上，采用PLS-DA模型進(jìn)一步分析熱應(yīng)激對(duì)奶牛血液代謝模式的影響，繼而篩選差異代謝物。從PLS-DA模型3D得分散點(diǎn)圖(圖3)可以看出，根據(jù)相對(duì)峰面積，熱應(yīng)激組與恢復(fù)組被明顯區(qū)分開(kāi)，18個(gè)樣品均在95%的置信區(qū)間。PLS-DA載荷圖代表了變量對(duì)分類(lèi)的影響，距中心越遠(yuǎn)，表明變量具有更高的VIP值(Variable importance in the projection)，VIP值大于1.0的變量被視為對(duì)分類(lèi)具有重要意義的變量。根據(jù)變量載荷圖和VIP值(圖4)，VIP值大于1.0的8個(gè)代謝物被選為奶牛熱應(yīng)激的差異代謝物或潛在生物標(biāo)志物(表1)。

A.20個(gè)樣品；B.18個(gè)樣品A.The PCA model of 20 samples；B.The PCA model of 18 samples圖2 奶牛血漿PCA 得分散點(diǎn)圖Fig.2 PCA score plots of dairy cows plasma

圖3 奶牛血漿PLS-DA 3D得分散點(diǎn)圖Fig.3 PLS-DA 3D score plots of dairy cow plasma

2.3 生物標(biāo)志物的鑒定和代謝通路分析

根據(jù)NIST，8個(gè)奶牛熱應(yīng)激生物標(biāo)志物的結(jié)構(gòu)被確認(rèn)(表1)，各生物標(biāo)志物衍生化后的質(zhì)譜碎片(RI)見(jiàn)圖5所示。其中恢復(fù)組葡萄糖、α-亞麻酸、亞油酸、甘油、棕櫚酸、β-羥丁酸和甘氨膽酸鹽含量較熱應(yīng)激組明顯降低(P<0.05)，而乳酸含量明顯升高(P<0.01)(表1)。為了進(jìn)一步解釋熱應(yīng)激對(duì)奶牛生理機(jī)制的影響，8個(gè)生物標(biāo)志物被輸入KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了代謝通路分析，結(jié)果顯示，熱應(yīng)激過(guò)程中，糖酵解途徑被抑制，而能量代謝、脂肪酸氧化、甘油分解代謝增強(qiáng)，并且伴有肝功能障礙的生理現(xiàn)象。

3 討 論

泌乳牛處于能量負(fù)平衡的生理狀態(tài)，據(jù)報(bào)道，熱應(yīng)激時(shí)奶牛能量消耗增加，血糖濃度降低[13-14]。本研究采用GC-MS代謝組學(xué)技術(shù)也證實(shí)恢復(fù)組奶牛血糖濃度低于熱應(yīng)激組，即奶牛在應(yīng)激過(guò)程中血糖濃度呈降低趨勢(shì)，說(shuō)明葡萄糖氧化途徑活性增強(qiáng)，以提供更多的能量彌補(bǔ)熱應(yīng)激所致的能量過(guò)度消耗。這在一定程度上加劇了奶牛能量負(fù)平衡狀態(tài)。

研究結(jié)果進(jìn)一步表明，恢復(fù)組α-亞麻酸、亞油酸、棕櫚酸和β-羥丁酸的含量低于熱應(yīng)激組，這與L.Calamari等的報(bào)道相一致[14]，說(shuō)明應(yīng)激奶牛自身通過(guò)增強(qiáng)脂肪酸β-氧化活性，釋放更多的能量來(lái)彌補(bǔ)應(yīng)激所致的能量過(guò)度消耗。已知甘油代謝與糖代謝關(guān)系十分密切，血中的甘油被運(yùn)送至肝組織，主要在甘油激酶的催化下轉(zhuǎn)變成3-磷酸甘油，然后脫氫生成磷酸二羥丙酮，后者循糖的分解途徑進(jìn)一步代謝或者進(jìn)入糖的異生途徑轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟腔蛱窃?。本研究結(jié)果顯示，恢復(fù)組奶牛血液中甘油的含量低于應(yīng)激組，說(shuō)明熱應(yīng)激時(shí)甘油分解代謝途徑活性增強(qiáng)，這同樣有利于彌補(bǔ)應(yīng)激所致的能量不足。

目前尚無(wú)熱應(yīng)激時(shí)奶牛血中乳酸含量變化的相關(guān)報(bào)道。本研究采用GC-MS代謝組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激組奶牛血中乳酸含量低于恢復(fù)組，表明在應(yīng)激過(guò)程中糖酵解途徑的活性被抑制，這與應(yīng)激時(shí)脂肪酸β-氧化活性增強(qiáng)可相互印證，因?yàn)樵缙诘难芯恳呀?jīng)證實(shí)，脂肪酸β-氧化活性增強(qiáng)，細(xì)胞中檸檬酸的濃度升高，檸檬酸可通過(guò)抑制磷酸果糖激酶以減慢糖酵解途徑的活性過(guò)程。另?yè)?jù)報(bào)道，熱應(yīng)激時(shí)由于碳酸氫鹽的變化致使奶牛血液pH呈現(xiàn)從堿中毒到酸中毒的晝夜節(jié)律性變化，并且在氣溫涼爽的晚上表現(xiàn)出代謝性酸中毒的狀態(tài)[15]。本研究中熱應(yīng)激時(shí)乳酸含量的變化也呈現(xiàn)出這種晝夜規(guī)律性的變化趨勢(shì)。乳酸因其強(qiáng)酸性對(duì)血液pH也有較大的影響，因此推測(cè)，熱應(yīng)激時(shí)奶牛血液pH晝夜節(jié)律性變化不僅與過(guò)度呼吸所致的碳酸氫鹽的濃度有關(guān)，同時(shí)也與乳酸含量變化有關(guān)。

表1 熱應(yīng)激組與恢復(fù)組生物標(biāo)志物含量比較(平均值±SD)

Tables 1 Comparison of biomarker contents between heat stress and recovery cows (mean±SD)

代謝物Metabolite保留時(shí)間/minRetentiontimeVIP值VIPvalue熱應(yīng)激組(n=8)Heatstressgroup恢復(fù)組(n=10)Recoverygroupα?亞麻酸Alpha?Linolenicacid18．062．210．088±0．0180．059±0．026?亞油酸Linoleicacid23．711．640．009±0．0070．005±0．003?乳酸Lactate12．481．502．465±0．6898．889±0．558??D?葡萄糖D?glucose24．081．380．193±0．0550．151±0．084?甘油Glycerol15．511．150．732±0．1850．673±0．208?棕櫚酸Hexadecanoicacid28．011．090．401±0．1950．337±0．193?甘氨膽酸鹽Glycocholate21．901．480．009±0．0030．007±0．003?β?羥丁酸β?Hydroxybutanoate14．981．300．017±0．0130．009±0．005??

Compared with heat stress cows：*.P<0.05，**.P<0.01

圖4 奶牛血漿PLS-DA載荷圖(A)和VIP(B)Fig.4 Loading plot (A) and VIP plot (B) of PLS-DA for dairy cow plasma

A.α-亞麻酸；B.亞油酸；C.乳酸；D.D-葡萄糖；E.甘油；F.棕櫚酸；G.甘氨膽酸鹽；H.β-羥丁酸A.Alpha-Linolenic acid；B.Linoleic acid；C.Lactate；D.D-glucose；E.Glycerol；F.Hexadecanoic acid；G.Glycocholate；H.β-Hydroxybutanoate圖5 熱應(yīng)激生物標(biāo)志物衍生物的GC-MS質(zhì)譜圖Fig.5 Mass spectra of derivative of heat stress biomakers

眾所周知，膽汁酸在肝中由膽固醇轉(zhuǎn)化生成，然后排入腸腔，大約95%的膽汁酸被重吸收后經(jīng)門(mén)靜脈返回肝，僅有少部分進(jìn)入血液循環(huán)。因此血液膽汁酸的濃度高低取決于肝功能的狀態(tài)，當(dāng)肝損傷時(shí)血中膽汁酸濃度極易升高。甘氨膽酸鹽是膽汁酸的主要成分，因此血中甘氨膽酸鹽是目前公認(rèn)的反映肝損傷的最敏感指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，熱應(yīng)激組奶牛血中甘氨膽酸鹽的含量高于恢復(fù)組奶牛，說(shuō)明熱應(yīng)激有可能引起肝功能障礙，盡管在本試驗(yàn)中甘氨膽酸鹽的升高僅僅是生理性升高。據(jù)報(bào)道，熱應(yīng)激可導(dǎo)致奶?？寡趸芰ο陆礫16-18]，因此可以推測(cè)甘氨膽酸鹽含量升高可能與熱應(yīng)激時(shí)抗氧化能力下降，肝組織脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān)。

4 結(jié) 論

本研究采用GC-MS代謝組學(xué)方法研究了熱應(yīng)激對(duì)奶牛血液內(nèi)源性小分子物質(zhì)代謝的影響，8個(gè)代謝物被確定為熱應(yīng)激潛在的生物標(biāo)志物，結(jié)構(gòu)鑒定確認(rèn)為葡萄糖、α-亞麻酸、亞油酸、甘油、棕櫚酸、β-羥丁酸、甘氨膽酸鹽和乳酸。代謝通路分析顯示，熱應(yīng)激加劇了泌乳牛能量負(fù)平衡的狀態(tài)，主要通過(guò)增強(qiáng)脂肪酸氧化和甘油分解代謝途徑的活性，抑制糖酵解過(guò)程來(lái)緩解應(yīng)激時(shí)能量負(fù)平衡的生理狀態(tài)，在此過(guò)程中伴有肝功能障礙的生理現(xiàn)象。研究結(jié)果對(duì)進(jìn)一步闡明奶牛熱應(yīng)激的生理機(jī)制具有重要的科學(xué)意義。

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(編輯 郭云雁)

Blood Metabolomic Studies of Heat Stress Cow with GC-MS

GUO Yan-sheng，JIA Qi-peng，TAO Jin-zhong*

(DepartmentofAnimalScience，SchoolofAgriculture，NingxiaUniversity，Yinchuan730020，China)

The study aimed to reveal the effects of heat stress on dairy cow blood metabolites and its metabolic pathways in a systematic way.According to the criteria for evaluating cow heat stress，10 high milk yield Holstein cows in heat stress status were selected as heat stress group，these cows were regarded as recovery group again until their rectal temperature and respiratory rate returned to the normal range at next morning.Blood samples of each group were collected via tail vein and the plasm were separated.And then we developed and applied a gas chromatography-mass spectrometry GC-MS metabolomics protocol combined with pattern recognition approaches to search differential metabolites between the heat stress and recovery groups，and the differential metabolites were analyzed by KEGG for reconstructing the metabolic pathway and functional analysis.8 metabolites were selected as heat stress potential biomakers and indentified.These biomarkers included alpha-linolenic acid，linoleic acid，lactate，D-glucose，glycerol，hexadecanoic acid，glycocholate and β-Hydroxybutanoate.The content of lactate in heat stress status increased，the other metabolites decreased.Functional pathway analysis revealed that heat stress aggravated the state of energy negative balance in cow，and the lactating dairy cow blood metabolically responded to heat stress through increasing β-oxidation of fatty acid and glycerol metabolic and decreasing in glycolosis activity accompanied with liver dysfuction.The study may provide a strong evidence for further researching the physiological mechanism of heat stress cow.

heat stress；dariy cows；metabonomics；GC-MS；blood metabolites

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.08.011

2014-11-12

寧夏自然科學(xué)基金(NZ12151)

郭延生(1978-)，男，甘肅莊浪人，博士，副教授，主要從事臨床獸醫(yī)學(xué)研究，E-mail：guoyansheng1978@163.com

*通信作者：陶金忠，副教授，E-mail:tao_jz@nxu.edu.cn

S815.4

A

0366-6964(2015)08-1356-07