酶聯(lián)免疫吸附法測定畜禽組織中恩諾沙星的殘留量

楊華生(貴陽市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，貴州貴陽 550081)

恩諾沙星，又稱乙基環(huán)丙沙星、恩氟沙星，相對分子質(zhì)量為359.4，于1994年投放市場。該藥具有廣譜抗菌效果，對霉菌和革蘭氏陰性菌效力強(qiáng)，具有很強(qiáng)的滲透性，能廣泛分布于組織中，內(nèi)服及肌肉注射可吸收迅速，30 min后血藥濃度達(dá)高峰，血藥濃度高，在體內(nèi)代謝為同樣具有抗菌活性的環(huán)丙沙星，幾乎所有組織的藥物濃度都高于血漿，特別有利于深部組織感染的治療，代謝物生成及消除緩慢。為預(yù)防與治療畜禽養(yǎng)殖過程中發(fā)生疾病，恩諾沙星被養(yǎng)殖戶廣泛和大量使用，同時(shí)也極容易形成此類獸藥及其代謝物在養(yǎng)殖動物產(chǎn)品體內(nèi)大量殘留并最終被人類食用，從而導(dǎo)致人體內(nèi)正常菌群產(chǎn)生耐藥性，引發(fā)中毒或過敏反應(yīng)，影響體內(nèi)核酸的合成。此外，該類藥物還能抑制小兒、孕婦和哺乳期女性軟骨生長，對有藥物過敏史或高敏體質(zhì)者危害甚大，老年肝腎功能不全患者更易發(fā)生藥物蓄積而增加不良反應(yīng)。恩諾沙星與布洛芬等非甾體類抗炎藥物合用可使神經(jīng)興奮閾值降低，引起抽搐，增加神經(jīng)系統(tǒng)毒性等危害［1］，歐盟規(guī)定在可食用動物組織中該藥的殘留不能大于30 μg/kg。為此對畜禽組織中恩諾沙星殘留進(jìn)行測定，并及時(shí)規(guī)范市場，預(yù)防此類藥物對消費(fèi)者造成傷害，而目前對該藥檢測比較便捷、實(shí)用的方法就是使用酶聯(lián)免疫吸附法檢測方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與設(shè)備 酶標(biāo)儀(帶450 nm波長濾光片)、離心機(jī)、勻質(zhì)機(jī)、渦旋振蕩器、恒溫培養(yǎng)箱(0～50℃)、冰箱(4～8 ℃)、20～200 μl吸頭及單道可調(diào)移液器、20～300 μl多通道可調(diào)移液器、V－型槽、感量0.01 g的天平、洗板機(jī)、50 ml量筒、500 ml燒杯、酶標(biāo)板密封膜。

1.2 試劑 甲醇、蒸餾水、可拆式已包被恩諾沙星特異性抗體的聚苯乙烯微孔條(8 行、12 列)、濃度分別為 0、0.5、1.5、4.5、13.5 和40.5 ng/ml恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品溶液、濃度為 1 000 ng/ml恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品為質(zhì)控材料、稀釋/洗滌緩沖液(濃縮)按照一定的比例稀釋后用于酶標(biāo)板的沖洗、酶標(biāo)抗原(濃縮)用酶標(biāo)抗原稀釋液稀釋后使用、單組分底物/發(fā)色劑用于酶的催化顯色、反應(yīng)終止液。除甲醇、蒸餾水、反應(yīng)終止液外的試劑外在使用前均應(yīng)儲存于2～8℃的冰箱中。此外，不含恩諾沙星的樣品作為質(zhì)控QC，用于加標(biāo)回收，對整個(gè)試驗(yàn)過程進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3 原理 在酶標(biāo)板上的微孔中已包被恩諾沙星的特異性抗體，通過加入恩諾沙星標(biāo)液或組織樣品中的恩諾沙星抗原和辣根過氧化物酶標(biāo)記的恩諾沙星抗原爭奪酶標(biāo)板微孔上抗體的結(jié)合位點(diǎn)［2］，在室溫孵育條件下發(fā)生競爭反應(yīng)，形成抗體/抗原復(fù)合物或抗體/酶標(biāo)抗原復(fù)合物，洗滌酶標(biāo)板，除去游離的酶標(biāo)記物，加上單組分底物/發(fā)色劑。在一定的溫度范圍內(nèi)，酶標(biāo)記抗原上的辣根過氧化物酶催化底物與發(fā)色劑發(fā)生顯色反應(yīng)。加入反應(yīng)終止液后反應(yīng)停止，同時(shí)反應(yīng)物的顏色由藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃色。在酶標(biāo)儀上450 nm波長處測定相應(yīng)的吸光度值，吸光度值與恩諾沙星濃度成半對數(shù)反比關(guān)系。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 組織樣品的制備。稱取1.00 g均質(zhì)后的組織樣品加入4 ml 70%甲醇溶液并渦旋振蕩1 min，4 000 r/min下離心10 min，移取上清液，用已稀釋的稀釋/洗滌緩沖液按1∶1的比例進(jìn)行稀釋，稀釋好的樣液用于試驗(yàn)分析，稀釋倍數(shù)為8。只吸取上清液，而不要摻雜固體樣品。

1.4.2 吸光度的測定。待所有試劑的溫度恢復(fù)至室溫(20～25℃)后，方可使用。為了降低邊緣效應(yīng)，建議在反應(yīng)過程中用酶標(biāo)板密封膠片將酶標(biāo)板密封。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)控或樣品要做2份平行試驗(yàn)，并做好加樣位置的記錄。酶標(biāo)板微孔的指定位置如表1所示，每個(gè)代號格代表2個(gè)孔，平行排列，因此12列則為6列，一般情況下不會排滿。

表1 用于酶標(biāo)板微孔分析的指定位置

將足夠標(biāo)準(zhǔn)和樣品所用數(shù)量的微孔條插入酶標(biāo)板。用單道移液器吸取標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液50 μl，分別加入到指定的微孔中，然后用多通道可調(diào)移液器吸取75 μl酶標(biāo)記物加入到每一個(gè)微孔中，用酶標(biāo)板密封膠紙將酶標(biāo)板蓋住。輕輕拍擊酶標(biāo)板數(shù)秒，室溫(20～25℃)暗處溫育30 min。翻轉(zhuǎn)酶標(biāo)板，甩出所有溶液，用已設(shè)置好洗版程序的洗板機(jī)進(jìn)行洗板(此清洗程序在沒有條件的情況下進(jìn)行手工操作)，洗液為已稀釋的稀釋/洗滌緩沖劑，一般清洗由灌注到甩出要重復(fù)4～5次。最后1遍沖洗完后，將酶標(biāo)板在吸水紙上拍干。(將液體甩出后不用翻轉(zhuǎn)，避免各孔中液體交叉污染［3］，直接扣于吸水紙上拍干即可)，立即移取125 μl底物到酶標(biāo)板上，然后輕輕拍擊酶標(biāo)板，在室溫(22～25℃)暗處溫育20 min左右，直至顯色充分，每孔加入100 μl終止液終止反應(yīng)，顏色會由藍(lán)色變?yōu)辄S色，立即在波長450 nm酶標(biāo)儀上讀取吸光度。

1.5 結(jié)果判定 分別計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)溶液、質(zhì)控和樣品的平均吸光值。以吸光度值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可得到質(zhì)控和樣品的吸光度值。將得到的數(shù)值乘以8即為實(shí)際結(jié)果。結(jié)果判定可采用定性及定量2種方法。

1.5.1 定性分析。用樣品的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值進(jìn)行比較，即得到其濃度范圍。假設(shè)樣品T1的吸光度值為1.625，樣品T2的吸光度值為1.269，標(biāo)準(zhǔn)品濃度及相應(yīng)吸光度值分別為:S1(0 ng/ml)為 2.147，S2(0.5 ng/ml)為 1.850，S3(1.5 ng/ml)為 1.498，S4(4.5 ng/ml)為 1.194，S5(13.5 ng/ml)為0.852，S6(40.5 ng/ml)為 0.490。

1.5.2 定量分析。

1.5.2.1 百分吸光率的計(jì)算。按照以下公式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品或樣品的百分吸光率:

式中，B為標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液的平均吸光度值;B0為0 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。

1.5.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)(Y軸)，以恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)(X軸)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到標(biāo)液或樣品吸光度值與其濃度的函數(shù)關(guān)系為:y= －14.276lnx+76.282(R 為0.999 6)。將樣品的百分吸光率代入關(guān)系式中，得到樣品所對應(yīng)的濃度，乘以樣品制備過程中對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即為樣品中恩諾沙星的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性結(jié)果 樣品T1的濃度范圍是0.5～1.5 ng/ml，再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中恩諾沙星殘留的濃度范圍;樣品T2的濃度范圍為1.5～4.5 ng/ml，再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中殘留藥物的含量范圍。

2.2 定量結(jié)果 樣品T1、T2含量半定量分別為8.344和26.663 μg/kg。若以大于或等于 30 μg/ml作為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，則T1和T2均為陰性樣品。

2.3 回收率驗(yàn)證 在質(zhì)控樣品QC1中加入100 μl濃度為1 000 ng/ml的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品作為質(zhì)控品，理論添加水平為100 μg/kg，其加標(biāo)樣品參與整個(gè)制備過程，實(shí)際測試時(shí)QC的吸光度為0.881。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到質(zhì)控樣品濃度，并乘以稀釋倍數(shù)，實(shí)測含量為94.583 μg/kg。按照公式回收率R(%)=(加標(biāo)樣品實(shí)際含量/加標(biāo)樣品理論含量)×100%計(jì)算出回收率為94.6%。由此可見，該檢測方法能充分滿足要求。

3 討論

(1)與氣質(zhì)及液質(zhì)聯(lián)用方法相比，該檢測方法的樣品制備較為簡便、快速，分析技術(shù)利用抗原抗體反應(yīng)的高度特異性和酶的高效催化作用相結(jié)合，具有耗時(shí)少、靈敏度高，通常從樣品制備到分析測試結(jié)果在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)完成，理論計(jì)算含量達(dá)到μg/kg級別，但藥品的特異性抗體、包被抗體、催化底物的結(jié)合酶等制備要求條件很高，相當(dāng)專業(yè)，成本也十分昂貴，一旦操作分析失誤，會造成較大浪費(fèi)。因此，整個(gè)分析操作過程在環(huán)境條件必須達(dá)到要求，操作要規(guī)范，并嚴(yán)格按照操作步驟進(jìn)行。

(2)由于不同樣品基質(zhì)的復(fù)雜性以及樣品制備過程可能產(chǎn)生某些未知副產(chǎn)物，從而與抗體發(fā)生某些非特異性吸附交叉反應(yīng)，檢測結(jié)果允許存在極少數(shù)量的假陽性，因而對陽性樣品還要進(jìn)一步進(jìn)行定性分析。目前，比較常用的分析方法有液相/串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS-MS)、氣相/串聯(lián)質(zhì)譜GC-MS-MS)。

［1］蔣萍.氟喹諾酮類藥物的不良反應(yīng)［J］.藥學(xué)實(shí)踐雜志，1999(2):116－118.

［2］陳佳，李紅梅，徐斐，等.辣根過氧化物酶酶標(biāo)抗原催化α-萘酚微量熱［J］.食品科學(xué)，2009(17):204 －206.

［3］于嘉屏.全自動生化分析儀及其試劑間化學(xué)污染對檢測結(jié)果的影響［J］.中國檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2007(11):1301－1302.