正常與早熟雄性中華絨螯蟹透明質(zhì)酸酶活性比較

劉歡，顧俊興，馮超，王海玲，穆淑梅，b，康現(xiàn)江，b

（河北大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院，b.河北省動物系統(tǒng)學(xué)與應(yīng)用重點實驗室，河北保定071002）

正常與早熟雄性中華絨螯蟹透明質(zhì)酸酶活性比較

劉歡a，顧俊興a，馮超a，王海玲a，穆淑梅a，b，康現(xiàn)江a，b

（河北大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院，b.河北省動物系統(tǒng)學(xué)與應(yīng)用重點實驗室，河北保定071002）

為分析透明質(zhì)酸酶在正常性成熟和性早熟中華絨螯蟹雄性生殖系統(tǒng)中活性的差異，進而對正常和早熟雄蟹的生殖能力進行評估，采用透明質(zhì)酸底物轉(zhuǎn)化法，測定正常和早熟中華絨螯蟹精巢以及副性腺中透明質(zhì)酸酶的活性，同時考察不同孵育溫度對酶活性的影響.研究結(jié)果顯示：正常性成熟個體的精巢和副性腺中的透明質(zhì)酸酶活性遠遠高于早熟個體的酶活性，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.01）；孵育溫度對透明質(zhì)酸酶活性基本上沒有影響；正常性成熟個體副性腺中透明質(zhì)酸酶活性高于精巢酶活性，性早熟個體副性腺中的透明質(zhì)酸酶活性極低，甚至無法檢出.

中華絨螯蟹；透明質(zhì)酸酶；酶活性；性早熟

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）俗稱河蟹（以下簡稱河蟹）、大閘蟹，隸屬節(jié)肢動物門（Arthropod）甲殼綱（Crustacca）十足目（Decapoda）方蟹科（Grapsidae）絨螯蟹屬（Eriocheir），是我國重要的經(jīng)濟水產(chǎn)養(yǎng)殖蟹類.性早熟蟹是指幼蟹培育過程中性腺當(dāng)年發(fā)育成熟，比正常的性成熟年齡提早1 a.早熟雄性河蟹雖性腺發(fā)育速度較快，但從其精子密度及成活率、頂體酶活力和抗氧化能力等各方面來看，均遠遠劣于正常河蟹[1].河蟹性早熟問題是制約河蟹養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的一個重要因素，也是經(jīng)濟甲殼動物發(fā)育調(diào)控的重要問題[2].

透明質(zhì)酸酶（hyaluronidase，HAase）廣泛存在于動物組織中，可以特異性地水解細胞外基質(zhì)成分透明質(zhì)酸，從而影響細胞分裂、細胞間的連接、生殖細胞的活動和胚胎發(fā)育等多種生命活動[3].根據(jù)來源和作用機理的不同，透明質(zhì)酸酶被分為3類：睪丸型透明質(zhì)酸酶、透明質(zhì)酸內(nèi)切-β-葡萄糖醛酸苷酶和細菌透明質(zhì)酸酶，又稱透明質(zhì)酸裂解酶[4].測定透明質(zhì)酸酶活性的方法中，最常用的是透明質(zhì)酸底物轉(zhuǎn)化法和DMAB法[5-6].

在人類和哺乳類動物體中，睪丸透明質(zhì)酸酶作為一種對生精及睪丸功能敏感的生化指標常被用于雄性個體的生殖能力分析.本文借鑒此類研究，采用透明質(zhì)酸酶底物轉(zhuǎn)化法測定正常和早熟雄性河蟹的精巢、副性腺在不同溫度下透明質(zhì)酸酶的活性，對正常和早熟雄性河蟹的生殖能力進行評估，以期為河蟹等經(jīng)濟水產(chǎn)動物的健康養(yǎng)殖和種質(zhì)保護提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用正常成熟及性早熟河蟹購于河北省唐山市.正常性成熟河蟹質(zhì)量為（79.2±3.7）g，早熟河蟹質(zhì)量為（20.1±2.0）g.暫養(yǎng)于實驗室水族箱中，備用.

1.2 儀器與試劑

儀器：微型電動組織勻漿機，美國KONTES公司；5430R高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；酶標儀，美國Molecular Devices公司.

試劑：透明質(zhì)酸鈉，北京Biotopped公司；N-乙酰氨基葡萄糖、對甲基氨基苯甲醛（DMAB）和透明質(zhì)酸酶，美國Sigma公司.所有試劑均為分析純.

1.3 方法

1.3.1 蛋白樣品制備

解剖正常性成熟和性早熟雄性河蟹，取精巢0.1 g和副性腺0.3 g置于冰上.分別按照質(zhì)量體積比1∶3和1∶2加入磷酸緩沖液（pH7.4）.利用微型電動組織勻漿機冰浴勻漿2min，在4℃、12 000 r/min下離心30min，上清液即為蛋白粗提液，記錄粗提液體積V樣品.

1.3.2 透明質(zhì)酸酶活性檢測

取上述蛋白樣品各100μL，分別加入質(zhì)量濃度為1.5mg/mL的透明質(zhì)酸鈉200μL，37℃/20℃分別孵育60min.加入90℃預(yù)熱的硼酸鈉150μL，煮沸3min.冷卻后加入DMAB顯色液1.8mL，37℃孵育20min，測定吸光值.以磷酸緩沖液代替樣品為陰性對照[7]；以透明質(zhì)酸酶代替樣品為陽性對照.以N-乙酰氨基葡萄糖作為標準品制作標準曲線.

透明質(zhì)酸酶活性測定：透明質(zhì)酸酶以透明質(zhì)酸鈉為底物，根據(jù)水解產(chǎn)生的N-乙酰氨基葡萄糖的量測定其活力.透明質(zhì)酸酶活力單位（U）定義：以37℃/20℃孵育條件下，每分鐘催化1μmol透明質(zhì)酸鈉水解所需的酶量定義為1U，即一個酶活力單位[8-9].

透明質(zhì)酸酶活力計算公式[9]：

式中：2.25表示測定酶活力時的加樣總體積；V樣品表示提取的蛋白粗提液的總體積；MN-乙酰氨基葡萄糖表示N-乙酰氨基葡萄糖的相對分子質(zhì)量；0.1表示酶促反應(yīng)體系中加入的蛋白粗提液的用量；60表示反應(yīng)時間為60min；m樣品表示稱取組織樣品的質(zhì)量.

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差表示（M±SD）.使用SPSS19.0統(tǒng)計分析軟件進行單因素方差分析.各組數(shù)據(jù)進行方差同質(zhì)性檢驗，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05）時選擇LSD分析，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）時選擇Tamhane’s T2（M）分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 透明質(zhì)酸酶活性測定結(jié)果

以N-乙酰氨基葡萄糖作為標準品制作標準曲線，方程為y=0.472x+0.046，R2=0.997.

根據(jù)實驗中所測得的各樣品吸光值以及N-乙酰氨基葡萄糖標準曲線方程，計算出各樣品中產(chǎn)生的N-乙酰氨基葡萄糖的量.根據(jù)酶活力公式，計算不同孵育溫度（37℃、20℃）下正常成熟和早熟雄性河蟹不同組織中透明質(zhì)酸酶的活性.性早熟河蟹中，3/4個體的副性腺樣品，由于其吸光值小于N-乙酰氨基葡萄糖濃度計算公式“y=0.472x+0.046”中的0.046，故由此計算得到的N-乙酰氨基葡萄糖的產(chǎn)生量為負值，說明樣品中透明質(zhì)酸酶活性極低，無法檢出.

2.2 正常與早熟雄性河蟹中透明質(zhì)酸酶活性比較

正常性成熟與性早熟河蟹精巢、副性腺中透明質(zhì)酸酶活性如表1所示，方差分析結(jié)果如表2所示.

表1 正常與早熟河蟹不同組織中透明質(zhì)酸酶的活性Tab.1 Activity ofhyaluronidase in different tissuesofnormal and precociousmale of E.sinensis U

表2 透明質(zhì)酸酶活性的方差分析Tab.2 Variance analysison activity of hyaluronidase

由表1和表2可知，早熟河蟹精巢中透明質(zhì)酸酶的活性顯著低于正常成熟河蟹精巢中透明質(zhì)酸酶的活性，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.01）.正常成熟河蟹副性腺中透明質(zhì)酸酶的活性較高，而早熟河蟹副性腺中透明質(zhì)酸酶活性極低，多數(shù)個體無法檢出，二者差異也具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.01）.

本研究中，正常成熟河蟹精巢和副性腺中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度分別為（14.650±4.452）mg/mL和（15.915± 3.385）mg/mL；早熟河蟹中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度分別為（13.875±4.024）mg/mL和（13.550±1.876）mg/mL.二者組織間的蛋白質(zhì)濃度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（p＞0.05）.而透明質(zhì)酸酶活性比較結(jié)果顯示，正常成熟河蟹的精巢、副性腺中透明質(zhì)酸酶活性明顯高于其在早熟河蟹相同2種組織中的活性，說明性腺的過早發(fā)育可以影響雄性生殖系統(tǒng)透明質(zhì)酸酶的活性.精子在精巢中形成，精巢中透明質(zhì)酸酶活性可能最終影響精子中透明質(zhì)酸酶的活性，從而影響精子質(zhì)量.劉強等[1]研究發(fā)現(xiàn)，早熟河蟹的精子頂體酶活性顯著低于正常成熟精子中的頂體酶活性，而且早熟河蟹精巢組織學(xué)和各級精細胞大小與正常蟹相比均趨于小型化，因此，該研究認為早熟河蟹精子頂體酶活性低與其性腺組織結(jié)構(gòu)和性細胞小型化的發(fā)育有關(guān).本實驗中早熟河蟹精巢的透明質(zhì)酸酶活性低也可能與其性腺組織結(jié)構(gòu)和性細胞小型化的發(fā)育有關(guān).副性腺能使包裹精子的精莢在經(jīng)過時精莢壁結(jié)構(gòu)松散，從而有利于精子在雌蟹排卵時的釋放[10-11].本研究檢測早熟河蟹副性腺的透明質(zhì)酸酶活性時，3/4的個體未檢測出有效數(shù)值，說明性早熟會導(dǎo)致副性腺中透明質(zhì)酸酶活性被抑制，其原因有待進一步研究.以往研究[10-11]發(fā)現(xiàn)，副性腺蛋白可以破碎精莢壁釋放精子；此前作者在提取河蟹精子的實驗操作中，亦發(fā)現(xiàn)早熟河蟹中副性腺蛋白破碎精莢的效率顯著下降.由此推測，早熟河蟹的副性腺中透明質(zhì)酸酶的活性受到抑制可能是其副性腺蛋白破碎精莢的效率顯著下降的原因之一，此推測有待進一步研究證實.總之，早熟河蟹副性腺透明質(zhì)酸酶的活性較低，可能會導(dǎo)致精子從精莢中游離困難，不利于雌、雄交配后的精卵結(jié)合.

2.3 孵育溫度對透明質(zhì)酸酶活性的影響

通常酶的活性與其反應(yīng)體系的溫度有關(guān).正常情況下，哺乳動物體內(nèi)透明質(zhì)酸酶的最適溫度為37℃；而河蟹是變溫動物，其生存最適溫度一般為19～25℃.因此，本實驗設(shè)置了37℃和20℃2個孵育溫度，觀察孵育溫度對透明質(zhì)酸酶活性的影響，結(jié)果如表3所示.由表3中的p值可以看出，不同孵育溫度下的透明質(zhì)酸酶活性差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（p＞0.05），說明河蟹體內(nèi)的酶活性可能不會隨外界環(huán)境溫度的變化而發(fā)生大幅度改變.

表3 不同孵育溫度下透明質(zhì)酸酶活性的比較Tab.3 Comparison ofhyaluronidaseactivity under different incubation temperatures

2.4 不同組織中透明質(zhì)酸酶活性的比較

同種類河蟹，相同孵育溫度下，檢測精巢和副性腺中透明質(zhì)酸酶活性.表4中的方差分析結(jié)果顯示，不論是早熟還是正常河蟹中，相同孵育溫度下精巢與副性腺中透明質(zhì)酸酶活性之間的差異都具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）.已有研究[12-14]發(fā)現(xiàn)，不同來源的透明質(zhì)酸酶具有不同的功能，因此活性可能存在差異.

表4 同類河蟹不同組織透明質(zhì)酸酶活性的比較Tab.4 Com parison ofhyaluronidase activities in different tissuesof same crab

3 結(jié)論

本實驗采用透明質(zhì)酸底物轉(zhuǎn)化法，分析不同孵育溫度（37℃和20℃）下正常與早熟雄性河蟹不同組織（精巢、副性腺）透明質(zhì)酸酶的活性差異.研究發(fā)現(xiàn)：2個孵育溫度對河蟹透明質(zhì)酸酶活性無影響；正常性成熟河蟹精巢和副性腺中的透明質(zhì)酸酶活性均顯著高于性早熟河蟹相同組織中的透明質(zhì)酸酶活性.正常河蟹中，副性腺中透明質(zhì)酸酶的活性顯著高于精巢中的酶活性；早熟河蟹中，副性腺中的透明質(zhì)酸酶活性非常低，2個孵育溫度下均檢測不到.由此認為，早熟將影響雄性河蟹的生殖能力.

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（責(zé)任編校 紀翠榮）

Com parison on the activity of hyaluronidase between normaland precociousmale of Eriocheir sinensis

LIUHuana，GU Junxinga，F(xiàn)ENGChaoa，WANGHailinga，MU Shumeia，b，KANGXianjianga，b
（a. College of Life Sciences，b. The Key Laboratory of Zoological Systematics and Application，Hebei University，Baoding 071002，Hebei Province，China）

In order to evaluate the reproductive capacity in normaland precociousmale crabs（Eriocheir sinensis），the differenceofhyaluronidase（HAase）activities in reproductive system between normaland precociousmale crabswasdetermined. The HAase activities in the testis and accessory sex gland were calculated by the method of substrate conversion.The influence of different incubation temperatures on the HAase activitieswas investigated aswell.The results showed that the activities of HAase in the testis and accessory sex gland of normalmale crabs were significantly higher than that in the precocious ones（p＜0.01）.Incubation temperature had imperceptible effect on the activity of HAase.In normal sexual maturationmale crabs，the HAase activities in the accessory sex gland were higher than that in the testis.In the precocious male crabs，the HAase activities in the accessory sex gland were extremely low,which even could notbe detected.

Eriocheir sinensis；hyaluronidase；enzymatic activity；sexual precocity

Q955

A

2015-03-13

國家自然科學(xué)基金資助項目（31202000，31272309）；河北省自然科學(xué)基金資助項目（C2011201028）；河北大學(xué)博士基金資助項目（2012-239）；河北省重點實驗室運行補助費資助項目（14967611D）.

劉歡（1989—），女，碩士研究生.

康現(xiàn)江（1964—），男，教授，主要從事細胞發(fā)育分化及其調(diào)控方面的研究.

1671-1114（2015）03-0102-03