基于線粒體Cytb基因序列探討花斑鰍三亞種的分類地位

陳詠霞，梁娜，李秀，潘曉睿，武大勇

（1.河北大學生命科學學院，河北保定071002；2.衡水學院生命科學系，河北衡水053000）

基于線粒體Cytb基因序列探討花斑鰍三亞種的分類地位

陳詠霞1，梁娜1，李秀1，潘曉睿1，武大勇2

（1.河北大學生命科學學院，河北保定071002；2.衡水學院生命科學系，河北衡水053000）

以線粒體DNA細胞色素b（Cytb）基因的全序列作為遺傳標記，探討花斑鰍3亞種（指名亞種Cobitismelanoleuca melanoleuca、北方鰍亞種C.m.granoei和格氏鰍亞種C.m.gladkovi）的分類地位.基于Kimura雙參數(shù)法計算河北花斑鰍指名亞種個體間的遺傳距離為0.2%～1.1%，俄羅斯花斑鰍指名亞種、北方鰍亞種和格氏鰍亞種之間的平均遺傳距離為0.1%～1.5%，而河北花斑鰍指名亞種與俄羅斯花斑鰍3個亞種之間的平均遺傳距離為1.7%～2.6%.分子系統(tǒng)樹顯示，花斑鰍分為兩大分支：分支I為河北花斑鰍指名亞種8個單倍型類群，分支Ⅱ含俄羅斯花斑鰍指名亞種、北方鰍亞種和格氏鰍亞種以及遼寧北方鰍亞種.結合已有研究結果得出：花斑鰍指名亞種僅分布于中國，而俄羅斯也僅有北方鰍亞種1個物種，兩者的分化時間約為2.50～3.09百萬年.

花斑鰍；線粒體細胞色素b基因；遺傳標記；遺傳距離；分類地位

鰍屬（Cobitis）隸屬于硬骨綱（Osteichthyes）鯉形目（Cypriniformes）鰍科（Cobitidae），為淡水底層魚類，喜棲息于砂泥底質的清澈流水環(huán)境中，少數(shù)棲息于湖泊內，廣泛分布于古北區(qū)和東洋區(qū)[1-2].據(jù)統(tǒng)計，世界鰍屬魚類約有84種[3-4]，是鰍科種類最為繁盛和分化最為明顯的屬之一.

鰍屬魚類因其高度的表型可塑性、兩性異型和小生境適應性，給該類群的形態(tài)分類與物種鑒定帶來很大困難[5-6]，導致其近緣種的分類和命名非?；靵y，同物異名現(xiàn)象時有發(fā)生[7-8].過去，鰍屬的模式種花鰍（C. taenia Linnaeus，1758）被認為是廣泛分布的多型種，歐亞大陸的許多鰍魚被記述為花鰍或其亞種.例如，Nichols[9]描記的新亞種花斑鰍（C.t.melanoleuca Nichols，1925，模式產地：中國山西省清徐縣附近的汾河），Rendahl[10]描記的新亞種北方鰍（C.t.granoei Rendahl，1935，模式產地：俄羅斯西伯利亞鄂木斯克附近的額爾齊斯河）以及Gladkov[11]描記的新亞種西伯利亞鰍（C.t. sibirica Gladkov，1935，模式產地：俄羅斯烏拉爾南部Turaoiak湖泊）.

Berg[12]認為北方鰍和西伯利亞鰍為同種，北方鰍是西伯利亞鰍的次定同物異名.Bǎcescu和Maier[13]將西伯利亞鰍提升為種.但是，Nalbant等[14]認為北方鰍是有效種名，并描記了蒙古鰍新亞種（C.granoeiolivai Nalbant，Holcík etPivnicka，1970，模式產地：蒙古后杭愛省色楞格水系鄂爾渾河支流Ogijn湖泊和Narijn河）.Vasil’eva[15]也認為北方鰍是西伯利亞鰍的先定同物異名，但是根據(jù)形態(tài)特征及核型分析，他否定了蒙古鰍亞種的有效性.Nalbant[5]研究了花斑鰍的模式標本（1920年采自中國山西清徐）和俄羅斯西伯利亞庫達河（Kuda）與Ordinskoe湖泊北方鰍標本的形態(tài)特征，指出花斑鰍與北方鰍并沒有明顯差異，并根據(jù)命名優(yōu)先原則，認為花斑鰍是北方鰍的先定同物異名，并認為花斑鰍廣泛分布于黃河以北包括韓國、蒙古、俄羅斯和哈薩克斯坦等地區(qū).Kottelat[16]對采自蒙古克魯倫河（Kherlen）、色楞格河（Selenge）和布爾干河（Bulgan）的魚類進行體色斑紋研究，也認為蒙古鰍亞種、北方鰍和西伯利亞鰍均為花斑鰍的次定同物異名.之后，Prokofiev[17]檢視采自蒙古鄂爾渾河（Orkhon）鰍魚的體色斑紋，將蒙古鰍亞種（C.granoeiolivai）提升為種.Vasil’ev等[18]依據(jù)核型分析，認為蒙古鰍和西伯利亞鰍是北方鰍的次定同物異名，并認為北方鰍是花斑鰍的亞種（C.melanoleuca granoei），同時又描記新亞種格氏花鰍（C.melanoleuca gladkovi Vasil’ev et Vasil’eva，2008，模式產地：俄羅斯Staraya Stanitsa州，Starodubovka村，頓河支流北頓涅茨河）.然而，Perdices等[8]依據(jù)Cytb、RAG1、S7和RHO等基因序列對采自俄羅斯的北方鰍亞種（C.m.granoei）、格氏花鰍亞種（C.m.gladkovi）和花斑鰍指名亞種（C.m. melanoleuca）進行研究后認為，北方鰍和格氏花鰍均為花斑鰍的次定同物異名.

雖然對花斑鰍及其亞種的分類地位進行了很多研究報道，但中國的種群數(shù)據(jù)缺乏，其研究結果仍存在疑問.為了進一步確立花斑鰍及其亞種的分類地位，本文通過分析中國、韓國、俄羅斯等地區(qū)花斑鰍及其亞種的線粒體Cytb基因序列在種間、亞種間的變異，以探討花斑鰍及其亞種的分類地位.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

采用電網和蝦籠捕撈鰍屬魚類.于2013年4—10月份采集于河北省拒馬河（易縣紫荊關）、洋河（下花園區(qū)雞鳴驛）、湯河（豐寧鄧珊子村）、灤河（塞罕壩）和白河（赤城縣田鄉(xiāng)）.標本浸泡于體積分數(shù)95%的乙醇中，-20℃保存?zhèn)溆?標本保存在河北大學博物館.

1.2 DNA提取、序列擴增及測定

采用上海捷瑞生物有限公司生產的細胞/組織基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）提取純化花斑鰍基因組DNA.用于擴增線粒體Cytb的引物分別為L14724（5′-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3′）和H15915（5′-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3′）[19].PCR反應體系總體積為50μL，其中：引物濃度1.0μmol/L各2μL，DNA模版4μL，2×Taq MasterMix Loading Dye 25μL，ddH2O 17μL.PCR反應條件為：95℃預變性3 min，95℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)30次；72°C延伸10min，4℃終止反應.

PCR產物經質量分數(shù)為1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用膠回收試劑盒（天根生化科技有限公司）進行PCR產物的回收和純化.純化后的PCR產物由北京諾賽基因組研究中心進行雙向測通.

1.3 基因序列信息及數(shù)據(jù)分析

從GenBank下載了花斑鰍指名亞種（C.m. melanoleuca）、格氏花鰍亞種（C.m.gladkovi）、北方鰍亞種（C.m.granoei）、西伯利亞鰍亞種（C.m.sibirica）（=北方鰍亞種）、喬氏鰍（C.choii）、太平鰍（C.pacifica）、四線鰍（C.tetralineata）和韓鰍（C.hankugensis）等鰍屬魚類28個個體的Cytb基因同源序列，與本研究所檢測的12個個體（白河（HBBH）2個個體、湯河（HBTH）2個個體、拒馬河（HBJMH）3個個體、洋河（HBYH）3個個體和灤河（HBLH）2個個體）的Cytb基因序列，共計40個一并分析.另選取與鰍屬親緣關系較近的薩瓦納鰍屬（Sabanejewia）的南斯拉夫薩瓦納鰍（Sabanejewia balcanica）作為外群進行系統(tǒng)發(fā)育分析，相關信息見表1.

使用BioEdit7.2.5軟件進行同源序列拼接、排列及手動矯正.用DnaSP 5.10軟件[20]確定所測序列的單倍型.利用MEGA 5.0軟件[21]對測定序列和GenBank下載的序列進行比對，排序后去除兩端冗余序列，統(tǒng)計序列的平均堿基組成、變異位點、簡約信息位點數(shù)、轉換/顛換比率（Ts/Tv）和遺傳距離，其中遺傳距離的計算采用Kimura雙參數(shù)進化模型.

表1 本研究中所分析的鰍屬魚類和來源Tab.1 Speciesand sourcesof Cobitis studied

采用最大似然法（ML）和貝葉斯法（BI）構建分子系統(tǒng)樹，并用jModelTest2.1.4軟件[22]選擇最適合的進化模型.運用MEGA 5.0軟件構建ML法的分子系統(tǒng)樹，替代模型為GTR，進行1 000次自展分支檢驗.應用MrBayes 3.0軟件[23]構建BI法分子系統(tǒng)樹，隨機選取起始樹，以后驗概率（posterior probability，PP）來表示各分支的可信度.替代模型根據(jù)hLRTs檢驗結果設定為“nst=6 rates=gamma”，計算出最適合的替代模型為GTR+G+I.馬爾科夫鏈的蒙特卡洛方法（Markov chain MonteCarlo process）設置為4條鏈同時運行2×106代，3條熱鏈1條冷鏈.計算2×106代，每100代對系統(tǒng)樹進行抽樣，最終得到20 001棵系統(tǒng)發(fā)育樹，重復一次以保證所獲得結果的準確度.將運行過程中所得的對數(shù)似然值（Log-likelihood scores）與相應代數(shù)進行作圖，找到對數(shù)似然值達到飽和的位置，飽和前的數(shù)據(jù)被作為老化樣本而舍棄.在舍棄老化樣本（burn-in=4 000）后，根據(jù)剩余的樣本構建一致樹（consensus tree）并計算相關參數(shù).

2 結果與分析

2.1 堿基組成及序列變異

所測定的河北省5條河流12個個體的線粒體Cytb基因序列（1 140 bp）中有8個單倍型序列（表1），與GenBank下載的28個同源序列合并分析.結果表明，鰍屬8種（亞種）36個Cytb單倍型序列的平均堿基組成為T 32.1%、C 24.8%、A 28.0%、G 15.1%，A+T含量（60.1%）高于C+G含量（39.9%），堿基組成表現(xiàn)出明顯的T偏倚.其中，第1密碼子位點C+G含量（50.3%）顯著高于第2和第3密碼子位點（分別為38.7%和30.7%）.

所分析序列共含有保守位點816個，約占序列總長（下同）的71.6%；變異位點數(shù)324個，約占28.4%；簡約信息位點255個，約占22.4%.全部位點中不變位點有1 045個，轉換位點有70個，顛換位點有17個，序列中的轉換明顯多于顛換，轉換顛換比值（Ts/Tv）平均為4.13，序列突變未達到飽和.其中不變位點數(shù)第2密碼子位點最多，有377個；而轉換位點和顛換位點均是第3密碼子位點最多，分別有58個和16個.

2.2 遺傳距離

表2列出了基于Kimura雙參數(shù)進化模型計算的鰍屬種（亞種）間的平均遺傳距離.結果顯示，鰍屬6種間平均遺傳距離最大的是西伯利亞鰍（=北方鰍亞種）和黑龍江鰍（19.1%），四線鰍與韓鰍的最小（8.8%）；種間遺傳距離明顯大于花斑鰍亞種間的平均遺傳距離（0.5%～2.6%）.在花斑鰍3個亞種中，亞種間的平均遺傳距離最大值為河北花斑鰍指名亞種與西伯利亞鰍（=北方鰍亞種）（2.6%），其次是河北花斑鰍指名亞種與北方鰍亞種、俄羅斯花斑鰍指名亞種（均為1.9%），最小值為俄羅斯花斑鰍指名亞種與北方鰍亞種、格氏花鰍亞種（均為0.5%），該最小值接近于花斑鰍亞種內的平均遺傳距離（0.1%～0.6%）.河北花斑鰍指名亞種與俄羅斯花斑鰍3個亞種間的平均遺傳距離（1.7%～2.6%）明顯大于俄羅斯花斑鰍3個亞種之間的平均遺傳距離（0.5%～1.4%）.

表2 基于Kimura雙參數(shù)進化模型的鰍屬8種（亞種）間Cytb基因單倍型的平均遺傳距離Tab.2 Averagegenetic distancesamong eight species（subspecies）of Cobitis for Cytb genehap lotypes according to Kimura-2-parametermodel%

2.3 分子系統(tǒng)進化樹

應用貝葉斯法（BI法）和最大似然法（ML法）分別構建了鰍屬魚類的分子系統(tǒng)進化樹（圖1和圖2），各分支的數(shù)字表示ML樹中該支的bootstrap支持率和BI樹中該支的后驗概率.兩系統(tǒng)樹的拓撲結構基本一致，鰍屬8種（亞種）36個個體分為2大類：第1大類（類群Ⅰ）由花斑鰍3個亞種和喬氏鰍以高置信度（BI 100%，ML 96%）聚在一起；黑龍江鰍、太平鰍、四線鰍和韓鰍4個種類聚為第2類群（類群Ⅱ）（BI85%，ML 82%）.

在類群Ⅰ中，分布于俄羅斯的北方鰍亞種、西伯利亞鰍亞種（=北方鰍亞種）、格氏花鰍亞種、花斑鰍指名亞種以及分布于我國遼寧的北方鰍亞種以低置信度（BI58%，ML 91%）聚為一支；分布于河北的花斑鰍指名亞種同樣以較低置信度（BI64%，ML 80%）聚為另一支，然后這2支以高置信度（BI100%，ML 100%）聚在一起構成一大分支.與此分支構成姐妹群關系的是由韓國喬氏鰍和分布于我國黑龍江的北方鰍亞種以高置信度（BI 100%，ML 100%）聚在一起構成的分支.

圖1 基于8種（亞種）鰍屬魚類Cytb基因單倍型構建的貝葉斯法（BI）分子系統(tǒng)樹Fig.1 M olecular phylogenetic tree of 8（subspecies）speciesof Cobitis based on Cytb gene hap lotepes using Bayesian（BI）inferencemethod

圖2 基于8種（亞種）鰍屬魚類Cytb基因單倍型構建的最大似然法（M L）分子系統(tǒng)樹Fig.2 M olecular phylogenetic tree of8（subspecies）species of Cobitis based on Cytb gene hap lotypesusing maximum likelihood inference（M L）method

3 討論

遺傳距離分析顯示，分布于河北的花斑鰍與分布于俄羅斯的花斑鰍3個亞種（花斑鰍指名亞種、北方鰍亞種和格氏鰍亞種）間的平均遺傳距離為1.7%～2.6%，大于河北花斑鰍個體間的遺傳距離（0.2%～1.1%），也大于俄羅斯花斑鰍3個亞種間的遺傳距離（0.1%～1.5%）.遺傳距離雖然不是物種的鑒別特征，但可以為物種的分類地位提供佐證[8].Bohlen等[24]基于Cytb基因序列對小亞細亞和巴爾干半島鰍屬魚類的研究中，斑條鰍（C.punctilineata）和瘤鰍（C.strumicae）的遺傳距離為1.9%.Perdices等[8]基于Cytb基因序列分析俄羅斯境內的花斑鰍指名亞種、北方鰍亞種和格氏鰍亞種的遺傳距離（0.0%～1.3%），認為上述3個亞種的遺傳距離與地中海淡水魚類種內遺傳距離（＜2%）[25]相近，并以此為依據(jù)，認為俄羅斯地區(qū)僅有1個種，無亞種分化.由此可見，從遺傳距離來看，河北花斑鰍與俄羅斯花斑鰍之間的遺傳分化應屬于亞種級分化水平.

在系統(tǒng)進化上，分布于中國河北、遼寧和俄羅斯的花斑鰍以高置信度（BI 100%，ML 100%）聚為一支單系，其中分布于中國河北的花斑鰍聚為一支，而分布于遼寧和俄羅斯的花斑鰍聚為另一支，雖然兩分支的置信度（分別為BI 64%和ML 80%；BI 58%和ML 91%）相對較低，但提示兩者已有分化，系統(tǒng)發(fā)育關系的結果與遺傳距離顯示的結果一致.從地理起源和演化上看，鰍屬魚類從中新世，約15百萬年前[26]由中國南方向北擴散，經中國東部、日本、朝鮮、蒙古到達歐洲和北非[27-28].花斑鰍分布廣泛，從中國黃河以北到韓國、蒙古、俄羅斯至哈薩克斯坦均有分布[4].遼寧北方鰍亞種在地理分布上，介于河北花斑鰍和俄羅斯花斑鰍之間.系統(tǒng)進化上，遼寧北方鰍亞種與俄羅斯花斑鰍3個亞種具有較近的親緣關系，遺傳分化程度也支持二者聚為一支；遼寧北方鰍亞種與俄羅斯花斑鰍3個亞種的遺傳分化（遺傳距離為0.9%～1.4%）明顯低于其與河北花斑鰍的遺傳分化（遺傳距離為1.7%～2.2%）.由于本研究中遼寧北方鰍亞種Cytb序列僅1條，不排除因序列少導致該亞種在系統(tǒng)樹分析中位置有差異.但以上分析表明，河北花斑鰍與俄羅斯花斑鰍為亞種級分化水平.

俄羅斯花斑鰍亞種名為北方鰍（C.m.granoei）還是西伯利亞鰍（C.m.sibirica），國內外學者存在明顯分歧.Berg[12]和Bǎcescu等[13]認為北方鰍是西伯利亞鰍的次定同物異名.但是，Nalbant等[14]、Vasil’eva[15]、Vasil’ev等[18]認為北方鰍是西伯利亞鰍的先定同物異名.Bogutskaya等[29]研究這2個種名的先定性時，認為北方鰍（C.t.granoei）刊載時間（于1935年10月16日刊載于《NaturaeNovitiates》）早于西伯利亞鰍（C.t.sibirica）（于1935年11月19日刊載于《Naturae Novitiates》）.因此，根據(jù)命名優(yōu)先原則，俄羅斯花斑鰍亞種名為北方鰍亞種（C.m.granoei），分布于遼河以北至韓國、蒙古、俄羅斯和哈薩克斯坦；花斑鰍指名亞種（C.m. melanoleuca）分布于黃河以北至河北境內.按鰍屬魚類線粒體Cytb的進化速率為每百萬年變化0.68～0.84的模型計算[8]，花斑鰍指名亞種和北方鰍亞種的分歧年代距今為2.50～3.09百萬年.

本研究中，分布于中國黑龍江的北方鰍亞種與韓國喬氏鰍以高置信度（BI 100%，ML 100%）聚為一支單系，系統(tǒng)發(fā)育結果與遺傳分化程度一致；黑龍江北方鰍亞種與其他花斑鰍亞種的遺傳分化（平均遺傳距離為14.1%～15.2%）已達到種的分化水平，而與韓國喬氏鰍的遺傳分化（遺傳距離為0.3%～1.1%）屬于種內分化范圍.因此，根據(jù)該研究的成果，黑龍江的北方鰍亞種應與喬氏鰍是同種，為我國的新紀錄種，但需結合形態(tài)特征作進一步研究.

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（責任編校 紀翠榮）

Taxonom ic statusof three subspeciesof Cobitismelanoleuca based on sequencesofm itochondrial cytochrome b gene

CHEN Yongxia1，LIANGNa1，LIXiu1，PANXiaorui1，WUDayong2
（1. College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002，Hebei Province，China；2. College of Life Sciences，Hengshui University，Hengshui 053000，Hebei Province，China）

The taxonomic status of three subspecies（Cobitismelanoleucamelanoleuca，C.m.granoei，C.m.gladkovi）of Cobitismelanoleuca was discussed based on the whole sequences ofmitochondrial cytochrome b gene taken as hereditary marker.The genetic distance was calculated by themethod of Kimura-2-parameter.The results showed that the individual genetic distance of C.m.melanoleuca in Hebei Province was 0.2%-1.1%;the average genetic distance among the three subspeciesof Cobitismelanoleuca in Russiawas0.1%-1.5%.And the average genetic distance between C.m.melanoleuc and the three subspeciesof Cobitismelanoleuca in Russiawas1.7%-2.6%.Themolecular phylogenic trees demonstrated that the speciesof Cobitismelanoleuca wasdivided into two distinctclades.One clade included eighthyplogroupsof C.m.melanoleuca in HebeiProvince;the other clade included the three subspecies in Russia and C.m.granoei in Liaoning Province in China. Based on the existing researches and the presentstudy，the conclusion was that C.m.melanoleuca only distributed in China and therewasonly one subspecies，i.e.C.m.granoei in Russia.The divergence time between these two subspecieswasabout 2.50-3.09Mya.

Cobitismelanoleuca；mitochondrial cytochrome b gene；hereditarymarker；genetic distance；taxonomic status

Q959.4

A

2015-04-25

國家自然科學基金資助項目（31372166）.

陳詠霞（1976—），女，副教授，主要從事魚類分類、系統(tǒng)發(fā)育與生物地理學方面的研究.

1671-1114（2015）03-0001-06