紅景天人參銀杏葉軟膠囊的研制

何正軍，趙文吉，尼科，賈國夫

（四川省草原科學(xué)研究院，四川成都611731）

紅景天人參銀杏葉軟膠囊的研制

何正軍，趙文吉，尼科，賈國夫*

（四川省草原科學(xué)研究院，四川成都611731）

以紅景天、人參、銀杏葉的提取物為主要原料，大豆油、蜂蠟等為輔料，經(jīng)原料前處理、配料、溶膠、壓丸、定型等工藝制成紅景天人參銀杏葉軟膠囊，進(jìn)行急性經(jīng)口毒性、三項(xiàng)遺傳毒性、三十天喂養(yǎng)試驗(yàn)，結(jié)果表明其無明顯毒副作用；亞硝酸鈉中毒試驗(yàn)和急性腦缺血試驗(yàn)，表明其具有提高缺氧耐受力的保健功能作用。

紅景天提取物；人參提取物；銀杏葉提取物；紅景天甙；軟膠囊

缺氧無處不在，日本醫(yī)學(xué)博士野田英世認(rèn)為“一切疾病的根源是缺氧癥”。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，世界各國因缺氧而導(dǎo)致處于亞健康狀態(tài)或患病的人群正在迅速增加。陳玉滿等[1]研究大花紅景天對(duì)小鼠的抗缺氧作用，表明大花紅景天能提高整體動(dòng)物的耐缺氧能力；吳萬征等[2]對(duì)西藏紅景天抗氧作用進(jìn)行了研究，說明西藏紅景天提取液能增強(qiáng)整體動(dòng)物在缺氧條件下的生存能力；戴壽榮[3]等探討紅景天對(duì)提高缺氧耐力和勞動(dòng)能力的機(jī)理，說明紅景天明顯提高動(dòng)物的耐缺氧能力；王麗云等[4]對(duì)復(fù)方紅景天抗缺氧作用研究，表明復(fù)方紅景天具有提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物抗缺氧的能力；龍怡[5]等研究紅景天有效成分對(duì)缺氧缺糖心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，表明紅景天對(duì)缺氧缺糖心肌細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)作用。林松毅等[6]研究了小白鼠在常壓缺氧和急性腦缺氧條件下使用人參等復(fù)方中藥功能液對(duì)其抗缺氧能力，表明對(duì)心、腦功能具有一定的保護(hù)作用；鄒焰等[7]探討人參等耐缺氧、耐疲勞及抗氧化作用，表明人參能提高小鼠耐缺氧的能力和有抗氧化作用；張愛民[8]以添加人參提取物的飼料飼喂小鼠，進(jìn)行密閉缺氧實(shí)驗(yàn)和游泳抗疲勞實(shí)驗(yàn)，表明人參可有效提高小鼠耐缺氧能力和抗疲勞能力；顧建蘭[9]等研究人參銀杏葉合劑對(duì)高原缺氧大鼠腦組織作用，表明人參銀杏合劑對(duì)高原缺氧腦損傷具有保護(hù)作用。明亮[10]等觀察銀杏葉提取物對(duì)小鼠缺氧的研究，表明銀杏葉提取物具有較好的耐缺氧作用；張衛(wèi)明[11]等通過銀杏葉對(duì)小鼠常壓耐缺氧評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)，說明銀杏葉具有顯著的耐缺氧作用。本試驗(yàn)根據(jù)紅景天、人參、銀杏的功能特點(diǎn)，研制出的具有提高疲勞耐受力功能的紅景天人參銀杏葉軟膠囊，并進(jìn)行了工藝流程、毒理學(xué)、功能性評(píng)價(jià)的研究，為生產(chǎn)提供參考。本品的研制對(duì)改善人類健康狀況和指導(dǎo)人類生產(chǎn)生活有著十分重要的意義。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料

紅景天提取物：干燥失重≤5%，西安雙德生物技術(shù)有限公司；人參提取物：干燥失重≤5%，湖北巨勝科技有限公司；銀杏葉提取物：干燥失重≤5%，西安四葉草生物科技有限公司；鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102：美國Moltox公司；乙醇、甲醇、亞硝酸鈉：成都市科龍化工試劑廠；環(huán)磷酰胺、鈉石灰、凡士林、棕氧化鐵、多氯聯(lián)苯：成都金山化學(xué)試劑有限公司；昆明種小鼠、SD大鼠：華西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，大豆油：成都市明禾春糧油食品有限公司。

1.2 設(shè)備與儀器

高速分散均質(zhì)機(jī)：上海中庸檢驗(yàn)設(shè)備有限公司；HTR實(shí)驗(yàn)型攪拌化膠罐：北京中天匯通科技有限公司；電熱恒溫水浴鍋：蘇州珀西瓦爾實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；光學(xué)顯微鏡：OLYMPUS奧林巴斯；全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀：法國Horiba ABX；BS-200全自動(dòng)生化分析儀：深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；電子天平：德國賽多利斯；ZTJSY-III型實(shí)驗(yàn)滴丸機(jī)：北京中天匯通科技有限公司；真空抽濾裝置、電爐，秒表，玻璃器皿等。

2 方法

2.1 工藝流程

工藝流程如圖1。

2.2 操作步驟

2.2.1 原料前處理

將符合質(zhì)量要求的紅景天、人參、銀杏葉的提取物進(jìn)行Co60輻照滅菌，劑量6 kGy，檢驗(yàn)合格后脫去外包裝進(jìn)入潔凈區(qū)。

2.2.2 內(nèi)容物配制

紅景天、人參、銀杏葉的提取物經(jīng)粉碎分別過80目篩，按配方比例精確稱量。將定量的大豆油加熱至70℃～75℃，加入蜂蠟，攪拌熔融，放冷即得油蠟混合液，依次加入紅景天、人參、銀杏葉的提取物，邊加邊攪拌。置真空均質(zhì)乳化機(jī)中乳化30min，真空（-0.06MPa～0.08 MPa）脫去氣泡得內(nèi)容物料液。

2.2.3 溶膠

按比例稱取檢驗(yàn)合格的明膠、甘油、純凈水、棕氧化鐵；先將純凈水和甘油加入化膠罐，加熱至70℃～80℃時(shí)加入明膠、棕氧化鐵，攪拌熬制1.5 h～2 h，真空（-0.06 MPa～-0.08 MPa）脫氣，然后將膠液80目過濾，置貯膠罐保溫55℃～65℃，備用。

2.2.4 壓丸

內(nèi)容物料液、膠液通過軟膠囊機(jī)制成軟膠囊。整個(gè)壓丸過程，溫度控制18℃～26℃，相對(duì)濕度30%～40%（應(yīng)檢測丸重，確保重量差異在合格范圍內(nèi)，檢查軟膠囊外觀，性狀是否正確，有無漏丸等現(xiàn)象）。

2.2.5 定型

壓制好的軟膠囊定型4h，溫度控制在18℃～26℃，相對(duì)濕度在30%～40%。

2.2.6 洗丸

用95%食用乙醇洗丸，直至軟膠囊表面光潔，無油脂后取出。

2.2.7 干燥

將洗丸后的軟膠囊置潔凈干燥室內(nèi)干燥，溫度24℃～28℃，相對(duì)濕度20%～30%，干燥24 h～36 h。

2.2.8 揀丸

將干燥的軟膠囊轉(zhuǎn)到揀丸室，人工操作者應(yīng)帶口罩、手套，除去大小丸、異性丸、癟丸、破裂丸等不合格的軟膠囊。

2.2.9 包裝

將合格產(chǎn)品采用PVC板和鋁箔泡罩進(jìn)行包裝。

2.2.10 檢驗(yàn)入庫

成品檢驗(yàn)合格后方可入庫。

圖1 工藝簡圖Fig.1 Process diagram

2.2.11 生產(chǎn)環(huán)境衛(wèi)生潔凈級(jí)要求

生產(chǎn)環(huán)境及管理符合保健食品GMP要求。

2.3 產(chǎn)品毒理學(xué)試驗(yàn)

2.3.1 小鼠急性毒性試驗(yàn)

選用體重為18 g～22 g的昆明小鼠20只，雌雄各半。取本品內(nèi)容物經(jīng)口給小鼠灌胃1次，灌胃體積為0.2 mL/10 g·bw，測本品內(nèi)容物比重為1.061 g/mL，折合劑量為21.22 g/kg·bw。灌胃前禁食16 h，灌胃后連續(xù)觀察兩周，記錄中毒表現(xiàn)及死亡情況。

2.3.2 Ames試驗(yàn)

采用經(jīng)鑒定符合要求的鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102四株菌株進(jìn)行試驗(yàn)。采用多氯聯(lián)苯（PCB）誘導(dǎo)的大鼠肝微粒體酶（S-9）作為體外代謝活化系統(tǒng)。試驗(yàn)設(shè)五個(gè)劑量分別為5 000、1 000、200、40、8μg/皿，同時(shí)設(shè)自發(fā)回變、溶劑對(duì)照和陽性突變劑對(duì)照。樣品配制時(shí)，無菌條件下稱取本品內(nèi)容物1.25 g加二甲基亞砜（DMSO）至25 mL，為5 000 μg/皿劑量，取此液5 mL加溶劑至25 mL配成1 000 μg/皿，以下3個(gè)劑量如此類推配制。試驗(yàn)時(shí)在頂層瓊脂中加入0.1 mL試驗(yàn)菌株增菌液、0.1 mL受試物溶液和0.5 mL S-9混合液（當(dāng)需要代謝活化時(shí)），混勻后倒入底層培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)每皿菌落數(shù)。如果受試物的回變菌落數(shù)超過自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍以上，并有劑量—反應(yīng)關(guān)系者定為陽性。整套試驗(yàn)在相同試驗(yàn)條件下重復(fù)做一次。

2.3.3 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)

采用間隔24 h兩次口灌胃法進(jìn)行試驗(yàn)。取體重為25g～30g的昆明小鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半。以40 mg/kg·bw劑量的環(huán)磷酰胺為陽性對(duì)照，大豆油為陰性對(duì)照。試驗(yàn)組高、中、低3個(gè)劑量分別為10.00、5.00、2.50g/kg·bw，分別取本品內(nèi)容物50.00、25.00 g和12.50 g加大豆油至100 mL，配成相應(yīng)劑量的受試液給小鼠灌胃（0.2 mL/10g·bw）。末次給樣后6 h頸椎脫臼處死動(dòng)物，取胸骨骨髓用小牛血清稀釋涂片，甲醇固定，Giemsa染色。光學(xué)顯微鏡下，每只動(dòng)物計(jì)數(shù)1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞（PCE），微核發(fā)生率以含微核的PCE千分率計(jì)，計(jì)數(shù)200個(gè)嗜多染紅細(xì)胞，計(jì)算嗜多染紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞的比值（PCE/NCE）。

2.3.4 小鼠精子畸形試驗(yàn)

取體重25 g～35 g的雄性昆明種小鼠25只，隨機(jī)分為5組，每組5只。以40 mg/kg·bw劑量的環(huán)磷酰胺為陽性對(duì)照，大豆油為陰性對(duì)照。試驗(yàn)組高、中、低3個(gè)劑量分別為10.00、5.00、2.50 g/kg·bw，分別取本品內(nèi)容物10.00、25.00 g和12.50 g加大豆油100 mL，配成相應(yīng)劑量的受試液給小鼠灌胃（0.2 mL/10g·bw）。每日灌胃一次，連續(xù)5 d，于末次灌胃后的第30天處死動(dòng)物，取雙側(cè)副睪，做精子涂片，伊紅染色，每只動(dòng)物計(jì)數(shù)1 000個(gè)結(jié)構(gòu)完整的精子，計(jì)算畸變精子發(fā)生率。2.3.530天喂養(yǎng)試驗(yàn)

取SD大鼠80只，雌雄各半，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為四組，即對(duì)照組及三個(gè)受試動(dòng)物組，每組20只，雌雄各半。設(shè)本品內(nèi)容物低、中、高劑量分別為0.83、1.67、3.33 g/kg·bw（相當(dāng)于人體推薦劑量的25、50、100倍）。低、中、高劑量受試液配制時(shí)分別稱取樣品16.60、33.40、66.60 g加大豆油定容至100 mL，對(duì)照組給予等體積大豆油，每日灌胃一次，灌胃體積為0.5mL/ 100g·bw連續(xù)30 d。實(shí)驗(yàn)期間所有動(dòng)物單籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水，每天觀察動(dòng)物的活動(dòng)和生長情況，每周加食2次，記錄給食量和剩食量，每周稱一次體重，計(jì)算食物攝入量和食物利用率。給受試物30 d后禁食16 h采血，禁食前和禁食后（采血前）稱量動(dòng)物體重。采血時(shí)，每只大鼠摘眼球采集兩份血：抗凝血用全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀測定血紅蛋白（Hb）、紅細(xì)胞壓積（HCT），進(jìn)行紅細(xì)胞（RBC）、白細(xì)胞（WBC）、血小板（PLT）計(jì)數(shù)及WBC分類。非抗凝血分離血清，用全自動(dòng)生化分析儀測定TP、ALB、ALT、Cr、BUN、AST、CHOL、TG和GLU。采用后頸椎脫臼處死動(dòng)物作大體解剖，稱肝、腎、脾、睪丸重量，計(jì)算臟／體比值，取肝、腎、脾、胃、十二指腸、睪丸、卵巢作病理切片檢查。在對(duì)各劑量組動(dòng)物作大體檢查未發(fā)現(xiàn)明顯病變和生化指標(biāo)改變時(shí)，只進(jìn)行最高劑量組及對(duì)照組動(dòng)物主要臟器的組織病理學(xué)檢查，如發(fā)現(xiàn)病變則對(duì)較低劑量組相應(yīng)器官及組織進(jìn)行檢查。

2.4 提高缺氧耐受力功能試驗(yàn)

2.4.1 劑量選擇

將昆明種小鼠120只，體重18 g～22 g，分為三個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別記為實(shí)驗(yàn)I組（常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)）、Ⅱ組（亞硝酸鈉中毒存活實(shí)驗(yàn)）、Ⅲ組（急性腦缺血性缺氧實(shí)驗(yàn)），每個(gè)實(shí)驗(yàn)組根據(jù)動(dòng)物體重隨機(jī)分為四組，每組10只。設(shè)本品低、中、高劑量分為0.167、0.333、1.000 g/kg· bw（分別相當(dāng)于人體的推薦劑量的5、10、30倍）。試驗(yàn)時(shí)，分別稱取本品內(nèi)容物1.67、3.33、10.00 g加大豆油至100 mL，配成相應(yīng)計(jì)量受試液，供各劑量組灌胃。對(duì)照組給予等體積動(dòng)物食用油。每日灌胃一次，灌胃量為0.1 mL/10g·bw，連續(xù)30 d。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由攝取飲水。每天觀察動(dòng)物的活動(dòng)及生長情況。

2.4.2 方法

2.4.2.1 常壓耐缺氧試驗(yàn)

各劑量組經(jīng)口連續(xù)給予不同濃度本品內(nèi)容物，對(duì)照組給予同等容量溶劑，與末次灌胃后1 h，將各組小鼠分別放入盛有5 g鈉石灰的25 mL磨口瓶內(nèi)（每瓶1只）用凡士林封瓶口，蓋嚴(yán)，使之不漏氣，立即計(jì)時(shí)，以呼吸停止為標(biāo)準(zhǔn)，觀察小鼠因缺氧而死亡的時(shí)間。

2.4.2.2 亞硝酸鈉中毒存活試驗(yàn)

各劑量組經(jīng)口連續(xù)給予不同濃度本品內(nèi)容物，對(duì)照組給予同等容量溶劑，于末次灌胃后1 h，各組動(dòng)物按240 mg/kg·bw劑量腹腔注射亞硝酸鈉（注射量為0.1 mL/10 g·bw），立即計(jì)時(shí)，記錄動(dòng)物存活時(shí)間。

2.4.2.3 急性腦缺血缺氧試驗(yàn)

各劑量組經(jīng)口連續(xù)給予不同濃度本品內(nèi)容物，對(duì)照組給予同等容量溶劑，與末次灌胃后1 h，各組動(dòng)物自頸部逐只斷頭，立即按秒表記錄小鼠斷頭后至張口喘氣停止時(shí)間。

2.5 結(jié)果與討論

1）小鼠急性毒性試驗(yàn)，表明對(duì)雌、雄小鼠的最大耐受劑量均大于21.22 g/kg·bw，屬無毒級(jí)；Ames試驗(yàn)、小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)、小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果均為陰性。30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)，表明0.83、1.67、3.33 g/kg·bw劑量的本品內(nèi)容物給SD大鼠灌胃30 d，實(shí)驗(yàn)期間，動(dòng)物生長發(fā)育良好，各劑量組體重、增重、食物利用率、血常規(guī)指標(biāo)、血生化指標(biāo)、臟器重量及臟器/體重比值與對(duì)照組比較，無顯著性差異（P>0.05）。大體解剖和組織病理檢查未見與本品內(nèi)容物有關(guān)的異常改變。本品內(nèi)容物30 d喂養(yǎng)對(duì)大鼠未見明顯毒副作用。

2）提高缺氧耐受力功能試驗(yàn)，表明經(jīng)口給予小鼠0.167、0.333、1.000 g/kg·bw劑量的本品內(nèi)容物30 d，1.000 g/kg·bw計(jì)量能明顯延長亞硝酸鈉中毒存活時(shí)間、急性腦缺血性缺氧耐受時(shí)間（P<0.05或p<0.01）。表明本品內(nèi)容物具有提高缺氧耐受力作用。

3 質(zhì)量指標(biāo)

質(zhì)量指標(biāo)見表1、表2、表3、表4。

表1 感官要求Table 1Sensory requirements

表2 有效成分含量要求Table 2Active ingredient content requirements

表3 理化指標(biāo)Table 3Physical and chemical requirements

表4 微生物學(xué)要求Table 4Microbiological requirements

4 結(jié)論

紅景天人參銀杏葉軟膠囊采用紅景天、人參、銀杏等主要功能原料科學(xué)配方，經(jīng)原料前處理、溶膠、壓丸、定型、洗丸、干燥、揀丸等工藝研制而成。該產(chǎn)品呈深棕色，標(biāo)志性成分主要為紅景天苷，產(chǎn)品具有較好的提高缺氧耐受力的保健功能，且無毒性、安全。

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Study on the Rhodiola Ginseng Ginkgo Soft Capsule

HE Zheng-jun，ZHAO Wen-ji，NI Ke，JIA Guo-fu*
（Sichuan Academy Of Grassland Sciences，Chengdu 611731，Sichuan，China）

With Rhodiolae crenulatae，Ginseng，Ginkgo folium extract as the main raw material，Soybean oil，beeswax for the accessories materials，The pre-treatment of raw materials，ingredients，sol，pressure pills，stereotypes，such as technology made Soft Capsule.Acute oral toxicity test，Three genotoxicity tests and thirty days feeding test show that it has no significant side effects.Sodium nitrite poisoning test and trials of acute cerebral ischemLa shows that it has improved the health functions of hypoxia tolerance role.

rhodiolae crenulatae extract；ginseng extract；ginkgo folium extract；salidroside；soft capsule

2013-12-02

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.02.022

四川省科技廳科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目資助（2014SC0035）

何正軍（1971—），男（漢），副研究員，碩士，研究方向：高原經(jīng)濟(jì)植物資源開發(fā)與利用

*通信作者：賈國夫（1972—），男（漢），副研究員，碩士，研究方向：高原經(jīng)濟(jì)植物資源開發(fā)與利用。