不同處理?xiàng)l件下絞股藍(lán)多糖含量的測(cè)定與比較

習(xí) 南，康 佳，李瑞娟，史萬(wàn)玉

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，保定071000）

絞股藍(lán)(Gynostemma pentaphyllum)，別名七葉膽、小苦藥、甘草蔓、福音草，屬葫蘆科多年草質(zhì)藤本植物[1],主要分布于長(zhǎng)江以南各省區(qū)?，F(xiàn)代藥理研究和臨床應(yīng)用證明，絞股藍(lán)在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、抗突變、抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)中樞神經(jīng)和心血管系統(tǒng)保護(hù)等多個(gè)方面具有較好的生物活性。而且有報(bào)導(dǎo)絞股藍(lán)多糖具有抗癌活性、顯著地免疫促進(jìn)作用、抗疲勞、抗氧化、抗衰老、降血糖作用等藥理活性[2]。隨著絞股藍(lán)多糖藥理活性的不斷發(fā)現(xiàn)和證實(shí)，絞股藍(lán)多糖越來(lái)越受到人們的關(guān)注的同時(shí)，其提取工藝也成為研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同方法提取絞股藍(lán)多糖，并對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定和比較，從而研得更為高效、經(jīng)濟(jì)的絞股藍(lán)處理方法以獲得絞股藍(lán)多糖得率的最大化，為絞股藍(lán)多糖的開(kāi)發(fā)利用提取依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 中藥 絞股藍(lán)飲片，絞股藍(lán)葉超微粉，絞股藍(lán)梗超微粉，4%絞股藍(lán)一次發(fā)酵液，4%絞股藍(lán)二次發(fā)酵液，由本院中獸醫(yī)試驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要試劑 葡萄糖對(duì)照品，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；蒽酮、無(wú)水乙醇、石油醚、濃硫酸，購(gòu)自保定市賽爾克試劑公司；蒸餾水，自制。

1.1.3 主要儀器 UV1750紫外分光光度計(jì)(日本島津)；冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技發(fā)展有限公司)；101-3AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；MP200A分析天平(雙圈牌)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 飲片中絞股藍(lán)多糖的提取方法

（1） 水煎煮法 稱取絞股藍(lán)飲片50g，加600m l蒸餾水，煎煮2次，每次1h,過(guò)濾，合并濾液。將濾液濃縮到100ml,加入乙醇，使濾液中的乙醇含量達(dá)到70%，置4℃冰箱中放置24h，過(guò)濾。將過(guò)濾后的沉淀物加500ml蒸餾水溶解，加熱濃縮到50ml，再加入乙醇，使其乙醇含量達(dá)到80%，置4℃冰箱靜置24h，過(guò)濾。將沉淀物用無(wú)水乙醇洗滌2-3次，真空干燥，得絞股藍(lán)多糖粗品，并稱重備用[3]。

（2）水提法稱取絞股藍(lán)飲片50g，加600ml蒸餾水，90℃回流提取2次，每次2h，過(guò)濾，合并濾液。將濾液濃縮到100ml，加入乙醇，使濾液中的乙醇含量達(dá)到70%，置4℃冰箱中放置24h，過(guò)濾。將過(guò)濾后的沉淀物加500ml蒸餾水溶解，加熱濃縮到50ml，再加入乙醇，使其乙醇含量達(dá)到80%，置4℃靜置24h,過(guò)濾。將沉淀物用無(wú)水乙醇洗滌2-3次，真空干燥，得絞股藍(lán)多糖粗品，并稱重備用[4]。

（3）醇?jí)A提法 稱取絞股藍(lán)飲片50g，加600m l醇?jí)A提取液（5%乙醇用NaOH調(diào)pH至12），90℃回流提取2次，每次2h，過(guò)濾，合并濾液。將濾液濃縮到100ml，加入乙醇，使濾液中的乙醇含量達(dá)到70%，置4℃冰箱中放置24h，過(guò)濾。將過(guò)濾后的沉淀物加500ml蒸餾水溶解，加熱濃縮到50ml，再加入乙醇，使其乙醇含量達(dá)到80%，置4℃冰箱靜置24h,過(guò)濾。將沉淀物用無(wú)水乙醇洗滌2-3次，真空干燥，得絞股藍(lán)多糖粗品，并稱重備用[5]。

（4）醇處理水提方法 稱取絞股藍(lán)飲片50g，加500ml80%乙醇回流提取2次，每次1h，過(guò)濾，棄醇提液，再加600ml的蒸餾水90℃回流提取2次，每次2h，過(guò)濾，合并濾液。將濾液濃縮到100ml，并在其中加入乙醇，使濾液中的乙醇含量達(dá)到70%，置4℃冰箱中放置24h，過(guò)濾。將過(guò)濾后的沉淀物加500ml蒸餾水溶解，加熱濃縮到50ml，再加入乙醇，使其乙醇含量達(dá)到80%，置4℃冰箱靜置24h,過(guò)濾。將沉淀物用無(wú)水乙醇洗滌2-3次，真空干燥，得絞股藍(lán)多糖粗品，并稱重備用[6]。

（5）石油醚醇處理水提法 稱取絞股藍(lán)飲片50g，先加500ml的石油醚，回流提取2次，每次1h。棄去提取液，再加500ml80%乙醇回流提取2次，每次1h。棄去提取液加600ml蒸餾水，90℃回流提取2次，每次2h，過(guò)濾，合并濾液。將濾液濃縮到100ml，并在其中加入乙醇，使濾液中的乙醇含量達(dá)到70%，置4℃冰箱中放置24h，過(guò)濾。將過(guò)濾后的沉淀物加500ml蒸餾水溶解，加熱濃縮到50m l，再加入乙醇，使其乙醇含量達(dá)到80%，置4℃靜置24h,過(guò)濾。將沉淀物用無(wú)水乙醇洗滌2-3次，真空干燥，得絞股藍(lán)多糖粗品，并稱重備用[7]。1.2.2 絞股藍(lán)多糖的含量測(cè)定 （1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的配制精密稱取干燥至恒定質(zhì)量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品200mg,定溶1000ml容量瓶中,即得葡萄糖標(biāo)液。

（2）蒽酮硫酸溶液的配制 精密稱取蒽酮200mg，溶解于100ml濃硫酸中，即得0.2%的蒽酮硫酸溶液。

（3）最大吸收波長(zhǎng)的選擇 采用蒽酮-濃硫酸比色法。精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液30ml，置于100ml容量瓶中定容。取稀釋后的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液1ml于試管中，再加入4ml的蒽酮硫酸溶液（冰水浴中進(jìn)行），各管加完后一起浸入沸水中，自水重新沸起準(zhǔn)確煮沸10min，立即冷卻到室溫。另以未加葡萄糖的溶液為參比,于紫外分光光度計(jì)上從400-700 nm范圍內(nèi)掃描。比較此范圍內(nèi)的吸光度大小，確定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的最大吸收波長(zhǎng)。

（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別精密移取葡萄糖標(biāo)液10、20、30、40、50m l置于100ml容量瓶中定容。按上述蒽酮-濃硫酸比色法操作，顯色后于紫外分光光度計(jì)上620nm處測(cè)定其吸光度A，以A為縱坐標(biāo)，C（對(duì)照品的濃度）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并計(jì)算回歸方程[8]。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

（5）樣品多糖含量測(cè)定分別精密稱取不同方法得到的干燥的多糖粗品20mg，于100m l容量瓶中定容得樣品溶液。按上述蒽酮-濃硫酸比色法操作，顯色后于紫外分光光度計(jì)上620nm處測(cè)定其吸光度。進(jìn)而計(jì)算出絞股藍(lán)全草中絞股藍(lán)多糖的含量，從而確定出最佳提取方案。

1.2.3 絞股藍(lán)超微粉與發(fā)酵液中多糖的提取與含量測(cè)定 稱取絞股藍(lán)葉與梗的超微粉各50g分別按上述所得的最佳提取方法進(jìn)行試驗(yàn)操作，得絞股藍(lán)多糖粗品后按2.2.2（3）中蒽酮-濃硫酸比色法操作，顯色后于紫外分光光度計(jì)上620nm處測(cè)定其吸光度。然后分別計(jì)算出絞股藍(lán)梗、葉細(xì)粉中提取的絞股藍(lán)多糖粗品中絞股藍(lán)多糖的含量進(jìn)行比較。

絞股藍(lán)發(fā)酵液采用直接醇沉處理提取絞股藍(lán)多糖。量取4%絞股藍(lán)一次發(fā)酵液與4%絞股藍(lán)二次發(fā)酵液各1000ml，濾除殘?jiān)髮V液濃縮至100ml，并在其中加入乙醇，使濾液中的乙醇含量達(dá)到70%，置4℃冰箱中放置24h，過(guò)濾。將過(guò)濾后的沉淀物加500ml蒸餾水溶解，加熱濃縮到50ml，再加入乙醇，使其乙醇含量達(dá)到80%，置4℃靜置24h，過(guò)濾。將沉淀物用無(wú)水乙醇洗滌2-3次，真空干燥，得多糖粗品，稱重。然后按2.2.2（3）中蒽酮-濃硫酸比色法操作，顯色后于紫外分光光度計(jì)上620nm處測(cè)定其吸光度，進(jìn)而計(jì)算出發(fā)酵液中絞股藍(lán)多糖含量。

2 結(jié)果

2.1 最大吸收波長(zhǎng)的選擇結(jié)果 經(jīng)紫外分光光度計(jì)在400-700nm范圍內(nèi)測(cè)定吸光度，得知葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的最大吸收波長(zhǎng)為620nm。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 經(jīng)紫外分光光度計(jì)在620nm處測(cè)定不同濃度對(duì)照品吸光度A，以A為縱坐標(biāo)，C（對(duì)照品的濃度）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1,得回歸方程:A=7.4261C+0.0937，R2=0.9943。

2.3 不同方法提取的絞股藍(lán)飲片中多糖粗品的含量 經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度后，計(jì)算得知不同方法提取的絞股藍(lán)飲片中絞股藍(lán)多糖粗品的含量，如表1所示，醇?jí)A提法測(cè)定的絞股藍(lán)多糖粗品的含量最高為49.1400mg/g。

2.4 不同部位的絞股藍(lán)粗多糖的含量 由表1和表2可以看出，絞股藍(lán)發(fā)酵液含量最高，超微粉次之，飲片中含量最低。并且絞股藍(lán)葉超微粉中多糖粗品含量明顯高于梗超微粉，二次發(fā)酵液絞股藍(lán)多糖粗品含量顯著高于一次發(fā)酵液。

2.5 不同方法提取的絞股藍(lán)飲片多糖粗品中絞股藍(lán)多糖的含量 通過(guò)計(jì)算得知絞股藍(lán)飲片粗多糖中絞股藍(lán)多糖的含量，如表3所示，醇?jí)A提法測(cè)定的多糖純度最高。比較絞股藍(lán)飲片、超微粉、發(fā)酵液中絞股藍(lán)多糖純度，如表4所示，以絞股藍(lán)發(fā)酵液含量最高，超微粉次之，飲片中含量最低。并且絞股藍(lán)葉超微粉中多糖粗品含量明顯高于梗超微粉，二次發(fā)酵液絞股藍(lán)多糖粗品含量顯著高于一次發(fā)酵液。

表1 絞股藍(lán)飲片中絞股藍(lán)粗多糖含量(mg/g）

表2 超微粉/發(fā)酵液中絞股藍(lán)粗多糖含量(mg/g）

表3 不同提取方法絞股藍(lán)粗多糖中絞股藍(lán)多糖含量（g/g）

表4 絞股藍(lán)多糖粗品中絞股藍(lán)多糖的含量（g/g）

3 討論與小結(jié)

在本實(shí)驗(yàn)中，比較五種提取方法所得的絞股藍(lán)多糖的含量發(fā)現(xiàn)，醇?jí)A提法是最佳的提取方法。這可能是是由于堿溶液對(duì)植物細(xì)胞起到破壁作用,醇溶液滲透作用較強(qiáng),在堿與醇的共同作用下,增加了多糖滲透率,降低多糖殘留量,達(dá)到提高提取率的目的[9]；多糖粗品的多糖含量最高有可能是醇?jí)A液中的乙醇可以溶解掉多糖中的單糖的緣故。水煎煮得到的絞股藍(lán)多糖稍少可能是因?yàn)榻g股藍(lán)多糖隨水蒸汽蒸發(fā)到了環(huán)境中。醇處理，石油醚醇處理方法得到的絞股藍(lán)多糖含量低于其他方法，也許是乙醇可以充分溶解絞股藍(lán)中的葡萄糖。

絞股藍(lán)超微粉中絞股藍(lán)多糖的含量明顯多于絞股藍(lán)飲片。超微粉碎技術(shù)能在一定程度上破壞絞股藍(lán)細(xì)胞壁，從而減少有效成分由內(nèi)向外傳遞的的阻力，增加了植物細(xì)胞的比表面積，使絞股藍(lán)粉體有效成分溶出更迅速，徹底[10]。

絞股藍(lán)葉與梗中的絞股藍(lán)多糖含量的比較證明，常常被人們棄之不用的絞股藍(lán)梗莖中仍然還有較高量的絞股藍(lán)有效成分，具有一定的藥用價(jià)值，我們應(yīng)該合理利用絞股藍(lán)梗莖，可以大大降低用藥成本，也可以降低用藥緊張的矛盾。

絞股藍(lán)液體發(fā)酵時(shí)，除菌絲體的大量繁殖外，同時(shí)還向液體培養(yǎng)基分泌了大量的胞外多糖，故而絞股藍(lán)發(fā)酵液提取的絞股藍(lán)多糖尤為多，并且二次發(fā)酵比之一次發(fā)酵提取的多糖更多[11]。

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