轉(zhuǎn)化左旋乙基甾烯雙酮的微生物篩選及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物研究

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

為了滿足甾體藥物日益增長的市場需求，從南方采集的新鮮樹皮中篩選出具有轉(zhuǎn)化新型甾體化合物左旋乙基甾烯雙酮活力的微生物米根霉.利用該菌對左旋乙基甾烯雙酮進(jìn)行生物催化，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng)純化、重結(jié)晶后，通過單晶衍射鑒定為 6，β-羥基-13，β-乙基-4-烯-3，17-二酮和 10，β-羥基-13，β-乙基-4-烯-3，17-二酮.通過高效液相色譜對轉(zhuǎn)化過程中的甾體化合物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化24，h后，底物左旋乙基甾烯雙酮、6，β-羥基化產(chǎn)物和10，β-羥基化產(chǎn)物的含量分別為28.4%、32.2%和35.7%.

左旋乙基甾烯雙酮；米根霉；生物催化

甾體藥物在臨床上具有極其重要的醫(yī)藥價值，通常在免疫調(diào)節(jié)、皮膚疾病治療及生育控制方面有較好的作用［1］.甾體化合物經(jīng)過化學(xué)或生物法修飾以后其藥理學(xué)活性會增強(qiáng)，微生物轉(zhuǎn)化能夠得到化學(xué)法難以合成的甾體衍生物［2］，因此在甾體藥物的生產(chǎn)中發(fā)揮著極其重要的作用.

目前，已報道的具有甾體藥物生物轉(zhuǎn)化活性的微生物多達(dá) 1，500種，其中真菌包括根霉屬［3-5］、曲霉屬［6-7］和青霉屬［8-11］等，但只有少數(shù)幾個微生物成功應(yīng)用到甾體藥物的工業(yè)生產(chǎn)中［12-13］.而且，現(xiàn)在已知的 5，000多種具有潛在價值的甾體化合物中已投放市場的并不多，隨著甾體藥物的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，具有甾體生物催化功能的新型微生物的分離和篩選成為近年來甾體藥物領(lǐng)域的研究熱點［14-15］.

左旋乙基甾烯雙酮是合成孕激素類藥物的重要中間體.關(guān)于該化合物的微生物轉(zhuǎn)化的研究已有一些相關(guān)報道［16-19］，反應(yīng)類型主要包括 11，α-羥基化反應(yīng)、15，α-羥基化反應(yīng)以及17，β，15，α-羥基化反應(yīng)，所得產(chǎn)物分別為合成高效口服避孕藥地索高諾酮、△15-D-18-甲基炔諾酮以及孕二烯酮的重要中間體.

為獲得具有潛在藥學(xué)價值的新型甾體化合物，本文以左旋乙基甾烯雙酮（13，β-乙基-4-烯-3，17-二酮）為底物，對實驗中所分離的霉菌菌株進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的篩選，并對優(yōu)勢菌株的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行了分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定.

1 材料與方法

1.1 菌種分離樣品

氣候濕潤的南方地區(qū)采集的新鮮樹木（銀杉、銀杏樹、桂花樹、松樹、柳樹、樟樹、桑樹、柑橘樹、榕樹、棕櫚等）的樹皮.

1.2 培養(yǎng)基

平板及斜面培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯 200，g、葡萄糖20，g、瓊脂15～20，g、自來水1，L，pH自然.

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 20，g、蛋白胨 20，g、酵母膏5，g、自來水1，L，pH 5.0.

1.3 霉菌菌株分離與純化

將新鮮樹皮剪成小片，置于 PDA平板培養(yǎng)基，28，℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng).待樹皮切片周圍處長出菌絲后，挑取菌落尖端部分的菌絲移至新鮮的 PDA培養(yǎng)基平板上，28，℃條件下培養(yǎng)，如此反復(fù)純化直至得到純化菌株，挑取培養(yǎng)皿內(nèi)的霉菌菌落接種于斜面培養(yǎng)基上，于4，℃冰箱冷藏備用.

1.4 培養(yǎng)與轉(zhuǎn)化方法

將斜面種子用無菌水配制成孢子懸浮液（108mL-1），按 4%接種量接入裝有 50，mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250，mL三角瓶中，28，℃、180，r/min條件下振蕩培養(yǎng)24，h后，加入預(yù)先用乙醇溶解的底物（最終底物質(zhì)量濃度為 1，g/L），繼續(xù)在相同培養(yǎng)條件下生物轉(zhuǎn)化24，h.

1.5 轉(zhuǎn)化結(jié)果分析方法

左旋乙基甾烯雙酮微生物轉(zhuǎn)化結(jié)果的檢測采用TLC法.取0.6，mL發(fā)酵液于1.5，mL EP管中，加入等體積乙酸乙酯劇烈振蕩抽提 2，min，靜置，取上層有機(jī)相點樣于 TLC板上，展開劑為 V（石油醚）∶V（乙酸乙酯）=1∶1，紫外分析儀254，nm波長下觀察底物轉(zhuǎn)化情況.

1.6 18S rDNA基因測序與同源性分析

采用真菌基因組 DNA提取試劑盒提取DNA，經(jīng) PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳得到目的條帶，PCR產(chǎn)物用回收試劑盒回收純化，委托北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測序.

18S rDNA序列結(jié)果采用 BLAST分析，找出與待測菌株同源性最高的已知分類菌種，鑒定其種屬.

1.7 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分離提取與鑒定

依照 1.4所述的方法進(jìn)行米根霉菌體培養(yǎng)和底物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化24，h后合并所有3，L發(fā)酵液，用等體積乙酸乙酯萃取，旋蒸濃縮后，濃縮液經(jīng)硅膠柱層析分離得到產(chǎn)物，產(chǎn)物通過結(jié)晶和重結(jié)晶得到產(chǎn)物單晶.

產(chǎn)物鑒定采用單晶衍射法.單晶 X射線衍射使用Bruker Apex II CCD衍射儀，以Mo Kα輻射（λ= 0.07，nm）作為衍射光源，采用 SMART程序在 293，K條件下掃描收集單晶衍射數(shù)據(jù).運(yùn)用 SAINT程序還原數(shù)據(jù)和SADABS程序進(jìn)行經(jīng)驗吸收矯正.結(jié)構(gòu)采用SHELXTL程序用直接法解出，并基于F2用全矩陣最小二乘法對結(jié)構(gòu)進(jìn)行精修.非氫原子采用各向異性熱參數(shù)精修.所有氫原子均為理論加氫并采用各向同性熱參數(shù)及跨式模型進(jìn)行修正.

1.8 轉(zhuǎn)化率的測定方法

轉(zhuǎn)化率的測定采用高效液相色譜（HPLC）法.色譜條件：采用C18柱（4.6，mm×250，mm，5，μm），流動相為 V（乙腈）∶V（水）=70∶30的混合溶液，流量0.8，mL/min，進(jìn)樣量 10，μL，柱溫 25，℃；UV 240，nm檢測.

2 結(jié)果與討論

2.1 具有高效甾體轉(zhuǎn)化能力菌株的篩選

用所篩選的霉菌對左旋乙基甾烯雙酮進(jìn)行甾體微生物轉(zhuǎn)化實驗，得到了一株轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)且底物特異性好的菌株5#，轉(zhuǎn)化結(jié)果如圖1所示，該菌催化左旋乙基甾烯雙酮生成兩個產(chǎn)物.

圖1 TLC法分析5#菌株轉(zhuǎn)化左旋乙基甾烯雙酮的產(chǎn)物Fig. 1 TLC analysis of transformation products by strain 5#

2.2 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的鑒定

通過單晶衍射鑒定該菌轉(zhuǎn)化左旋乙基甾烯雙酮（1）的產(chǎn)物分別為 6，β-羥基-13，β-乙基-4-烯-3，17-二酮（2）和 10，β-羥基-13，β-乙基-4-烯-3，17-二酮（3）.米根霉生物催化左旋乙基甾烯雙酮羥基化的反應(yīng)式如圖2所示.

圖2 13β-乙基-4-烯-3，17-二酮的羥基化反應(yīng)Fig. 2 Hydroxylation of 13β-ethyl-4-gonene-3，17-dione bystrain 5#

6，β-羥基-13，β-乙基-4-烯-3，17-二酮的晶體結(jié)構(gòu)如圖3所示.晶體數(shù)據(jù)：分子式C19，H26，O3，相對分子質(zhì)量 302.40，晶體尺寸 0.18，mm×0.17，mm× 0.16，mm，屬正交晶系，空間群為 P2（1）2（1）2（1）.晶胞參數(shù) a=0.97，nm，b=1.23，nm，c=1.35，nm，α= 90°，β=90°，γ=90°，晶胞體積 V=1.61，nm3，晶胞內(nèi)分子數(shù) Z=4，晶體計算密度 Dcalcd=1.247，mg/m3.測量溫度 173（2）K，吸收系數(shù) 0.083，mm-1，共收集到獨立衍射點 2，839個，結(jié)構(gòu)偏離因子 R1=0.038，2，wR2=0.093，2；R1=0.040，3，wR2=0.094，8.

圖3 6β-羥基-13β-乙基-4-烯-3，17-二酮的晶體結(jié)構(gòu)Fig. 3 Crystal structure of 6β-hydroxy-13β-ethyl-4-gonene-3，17-dione

10，β-羥基-13，β-乙基-4-烯-3，17-二酮的晶體結(jié)構(gòu)如圖4所示.

圖4 10β-羥基-13β-乙基-4-烯-3，17-二酮的晶體結(jié)構(gòu)Fig. 4 Crystal structure of 10β-hydroxy-13β-ethyl-4-gonene-3，17-dione

晶體數(shù)據(jù)：分子式 C19，H26，O3，相對分子質(zhì)量302.40，晶體尺寸 0.18，mm×0.14，mm×0.12，mm，屬正交晶系，空間群為 P2（1）2（1）2（1）.晶胞參數(shù) a= 0.73，nm，b=0.98，nm，c=2.30，nm，α=90°，β=90°，γ=90°，晶胞體積V=1.65，nm3，晶胞內(nèi)分子數(shù)Z=4，晶體計算密度 Dcalcd=1.216，mg/m3.測量溫度173（2）K，吸收系數(shù) 0.080，mm-1，共收集到獨立衍射點 2，881個，結(jié)構(gòu)偏離因子 R1=0.036，4，wR2= 0.084，1；R1=0.039，7，wR2=0.086，3.

化合物 6，β-羥基-13，β-乙基-4-烯-3，17-二酮（2）和 10，β-羥基-13，β-乙基-4-烯-3，17-二酮（3）均為已知化合物［20］，周維善等［21］利用黑根霉在左旋乙基甾烯雙酮的 C11，α，位引入羥基，同時得到了其他 3種羥基化產(chǎn)物，包括少量的 C6，β（18%）和 C10，β（9%）羥基產(chǎn)物.說明實驗中所篩選的米根霉具有較好的特異性生物催化左旋乙基甾烯雙酮羥基化的能力.

2.3 菌株分子生物學(xué)鑒定

依照 1.6所述的方法，將提取到的 5#菌株的DNA片段經(jīng)過PCR擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖5所示.

圖5 菌株5#的18S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果得到618，bp片段Fig. 5 618，bp DNA fragment amplified by PCR from 18S rDNA of strain 5#

根霉菌5#的18S rDNA序列測序結(jié)果顯示如下：TGCGGAAGGGGATCATTAATTATGTTAAAGCGCC TTACCTTAGGGTTTCCTCTGGGGTAAGTGATTGC TTCTACACTGTGAAAATTTGGCTGAGAGACTCA GACTGGTCATGGGTAGACCTATCTGGGGTTTGAT CGATGCCACTCCTGGTTTCAGGAGTACCCTTCAT AATAAACCTAGAAATTCAGTATTATAAAGTTTAAT AAAAAACAACTTTTAACAATGGATCTCTTGGTT CTCGCATCGATGAAGAACGTAGTAGCAAAGTGC GATAACTAGTGTGAATTGCATTCAGTGAATCGAG TCTTTGAACGCAGCTTGCACTCTATGGTTTTTCT ATAGAGTACGCCTGCTTCAGTATCATCACAAACC CACACATAACATTTGTTTATGTGGTGATGGGTCG CATCGCTGTTTTATTATTACAGTGAGCACCTAAA ATGTGTGTGATTTTCTGTCTGGCTTGCTAGGCAG GAATATTACGCTGGTCCTCAGGATCTTTTTTTTT GGTTCGCCCAGGAAGTAAAGTACAAGAGTATAA TCCAGTAACTTTCAAACTATTGATCTGAAGTCAG GTGGGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA AGCGGAGGA

將根霉菌5#的18S rDNA片段在GenBank中進(jìn)行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)該根霉菌株與米根霉（Rhizopus oryzae）的同源性為100%，證實該菌為米根霉.

2.4 轉(zhuǎn)化過程分析

米根霉轉(zhuǎn)化左旋乙基甾烯雙酮經(jīng)過 24，h得到兩個產(chǎn)物2和3，其高效液相圖如圖6所示.根據(jù)所鑒定的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的液相圖可知：液相3個主峰A、B、C分別為產(chǎn)物 2、3和底物 1，出峰時間分別為 3.626、3.972、6.745，min.

圖6 米根霉轉(zhuǎn)化左旋乙基甾烯雙酮的高效液相色譜分析Fig. 6 HPLC chromatogram of transformation products of 13，β-ethyl-4-gonene-3，17-dione by R. oryzae

轉(zhuǎn)化過程中的反應(yīng)物及產(chǎn)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)見表 1.轉(zhuǎn)化 6，h后發(fā)酵液中即可檢測到產(chǎn)物 2，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)在12，h后達(dá)到了16.2%，經(jīng)過24，h產(chǎn)率達(dá)到32.2%，之后濃度不再增加；產(chǎn)物3在轉(zhuǎn)化經(jīng)過7，h后開始產(chǎn)生，且產(chǎn)物量一直增加，最終達(dá) 35.7%.轉(zhuǎn)化達(dá)到24，h以后產(chǎn)物濃度不再隨著時間增加.

表1 轉(zhuǎn)化過程中的反應(yīng)物及產(chǎn)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Tab. 1 Composition of crude mixtures obtained in transformation by R. oryzae

米根霉對于甾體化合物如17，β-羥基雄甾-4-烯-3-酮［22］及環(huán)氧黃體酮［23］等具有 1，β、6，β、7，α、11，α，羥基化能力，本實驗所篩選的米根霉對左旋乙基甾烯雙酮的轉(zhuǎn)化結(jié)果表明具有 6，β、10，β羥基化能力，且所獲得的左旋乙基甾烯雙酮羥基化產(chǎn)率比周維善等［21］的報道有明顯提高.

3 結(jié) 語

本實驗發(fā)現(xiàn)米根霉對左旋乙基甾烯雙酮具有特異性的羥基化生物催化活性，所獲得的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物6，β-羥基-13，β-乙基-4-烯-3，17-二酮和10，β-羥基-13，β-乙基-4-烯-3，17-二酮為甾體藥物工業(yè)新藥的研發(fā)提供了一條新途徑；但對于 6，β-羥基-13，β-乙基-4-烯-3，17-二酮和 10，β-羥基-13，β-乙基-4-烯-3，17-二酮的藥理活性目前尚不清楚，后期將進(jìn)行相關(guān)研究.

［1］ Bhatti H N，Khera R A. Biological transformations of steroidal compounds：A review［J］. Steroids，2012，77（12）：1267-1290.

［2］ 李會，張明杰，張曉梅，等. 三羥基雄甾烯酮高轉(zhuǎn)化菌株的選育及工藝優(yōu)化［J］. 生物工程學(xué)報，2013，29（11）：1687-1691.

［3］ Zhou H L，Lu WY，Wen J P，et al. Kinetic analysis of 11，α-hydroxylation of steroids by Rhizopus nigricans［J］. Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2009，56（2/3）：136-141.

［4］ 茅燕勇，沈珈琦，范偉平. 葡枝根霉 NG0305酶催化甾體 C11，α-羥基化的研究［J］. 生物加工過程，2004，2（2）：46-51.

［5］ Martin G D A. Biotransformation reactions by Rhizopus spp.［J］. Current Organic Chemistry，2010，14（1）：1-14.

［6］ Mao S H，Hua B Y，Wang N，et al. 11，α-hydroxylation of 16，α，17-epoxyprogesterone in biphasic ionic liquid/ water system by Aspergillus ochraceus［J］. Journal of Chemical Technology and Biotechnology，2013，88（2）：287-292.

［7］ Hunter A C，Carragher N E. Flexibility of the endogenous progesterone lactonisation pathway in Aspergillus tamarii KITA：Transformation of a series of cortical steroid analogues［J］. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology，2003，87（4/5）：301-308.

［8］ Ko?ek T，Szpineter A，?wizdor A. Baeyer-Villiger oxidation of DHEA，pregnenolone，and androstenedione by Penicillium lilacinum AM111［J］. Steroids，2008，73（14）：1441-1445.

［9］ 李駿，耿旭，翁亮，等. Penicillium raistrickii 15，α羥基化左旋乙基甾烯雙酮工藝研究［J］. 微生物學(xué)通報，2005，32（5）：87-91.

［10］ Gao J M，Shen J W，Wang J Y，et al. Microbial transformation of 3，β-acetoxypregna-5，16-diene-20-one by Penicillium citrinum［J］. Steroids，2011，76（1/2）：43-47.

［11］ Bartmańska A，Dmochowska-G?adysz J，Huszcza E. Steroids' transformations in Penicillium notatum culture［J］. Steroids，2005，70（3）：193-198.

［12］ Faramarzi M A，Aghelnejad M，Tabatabaei Yazdia M，et al. Metabolism of androst-4-en-3，17-dione by the filamentous fungus Neurospora crassa［J］. Steroids，2008，73（1）：13-18.

［13］ Faramarzi MA，Badiee M，Tabatabaei Yazdia M，et al. Formation of hydroxysteroid derivatives from androst-4-en-3，17-dione by the filamentous fungus Mucor racemosus ［J］. Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2008，50（1）：7-12.

［14］ Fernandes P，Cruz A，Angelova B，et al. Microbial conversion of steroid compounds：Recent developments［J］. Enzyme and Microbial Technology，2003，32（6）：688-705.

［15］ Huang L H，Li J，Xu G，et al. Biotransformation of dehydroepiandrosterone（DHEA）with Penicillium griseopurpureum Smith and Penicillium glabrum （Wehmer） Westling［J］. Steroids，2010，75（13/14）：1039-1046.

［16］ Yang J，Yang S K，Yang Y L，et al. Microbial hydroxylation of 16，α，17，α-dimethyl-17，β-（l-oxopropyl）androstal，4-dien-3-one to rimexolone by Curvularia lunata AS 3. 4381［J］. Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2007，47（3）：155-158.

［17］ Donova M V，Egorova O V，Nikolayeva V M. Steroid 17，β-reduction by microorganisms：A review ［J］. Process Biochemistry，2005，40（7）：2253-2262.

［18］ Romano A，Romano D，Ragg E，et al. Steroid hydroxylations with Botryodiplodia malorum and Colletotrichum lini［J］. Steroids，2006，71（6）：429-434.

［19］ Andrushina V A，Druzhinina A V，Yaderets V V，et al. Hydroxylation of steroids by Curvularia lunata mycelium in the presence of methyl-β-cyclodextrine［J］. Applied Biochemistry and Microbiology，2011，47（1）：42-48.

［20］ Jekkel A，Ilk?y é，Horváth G，et al. Microbial hydroxylation of 13，β-ethyl-4-gonene-3，17-dione［J］. Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，1998，5（1/2/3/4）：385-387.

［21］ 周維善，蔡峰，沈季銘. 18-甲基腺甾烯酮一類物的酶催化羥化［J］. 化學(xué)學(xué)報，2001，59（4）：604-609.

［22］ Peart P C，Reynolds W F，Reese P B. The facile bioconversion of testosterone by alginate-immobilised filamentous fungi［J］. Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2013，95（1）：70-81.

［23］ Petri? ?，Hakki T，Bernhardt R，et al. Discovery of a steroid 11，α-hydroxylase from Rhizopus oryzae and its biotechnological application［J］. Journal of Biotechnology，2010，150（3）：428-437.

轉(zhuǎn)化左旋乙基甾烯雙酮的微生物篩選及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物研究

李宴清，毛淑紅，于 璐，劉曉光，路福平

Screening Strains for 13，β-ethyl-4-gonene-3，17-dione Biotransformation and the Characterization of the Products

LI Yanqing，MAO Shuhong，YU Lu，LIU Xiaoguang，LU Fuping
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）

To meet the market demand for steroidal drugs，a filamentous fungus，Rhizopus oryzae with novel 13，β-ethyl-4-gonene-3，17-dione transformation ability was screened from the fresh bark of south China. The biotransformation efficiency of 13，β-ethyl-4-gonene-3，17-dione by this strain was studied. The transformation products were purified，recrystallized and determined ，by the single crystal X-ray diffraction as 6 α-hydroxy-13，β-ethyl-4-gonene-3，17-dione and 10，β-hydroxy-13，βethyl-4-gonene-3，17-dione. The biotransformation process monitored by HPLC revealed that after 24，h fermentation，the products of substrates 13，β-ethyl-4-gonene-3，17-dione，C6，β and C10，β were 28.4%，32.2% and 35.7% respectively.

13，β-ethyl-4-gonene-3，17-dione；Rhizopus oryzae；biotransform

Q93 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1672-6510（2015）02-0016-05

10.13364/j.issn.1672-6510.20140060

2014-04-16；

2014-05-06

國家自然科學(xué)基金資助項目（21206127）

李宴清（1987—），女，湖北人，碩士研究生；通信作者：毛淑紅，副教授，shuhongmao@tust.edu.cn.

周建軍