抗真菌乳酸菌的篩選及其對饅頭和酸奶的防腐實驗

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

采用雙層平板點接法，從 140株植物乳桿菌中篩選出一株抗婁地青霉活性較高的菌株 IMAU80134，從酸粥中篩選出一株抗黃曲霉活性較高的植物乳桿菌TK9.對植物乳桿菌TK9和IMAU80134的抗真菌譜進行研究發(fā)現(xiàn)，兩株菌除分別對黃曲霉和婁地青霉有抑制作用外，對煙曲霉、柑橘青霉、草酸青霉也有不同程度的抑菌作用，其中植物乳桿菌TK9和IMAU80134對草酸青霉有相對較強的抑制作用，抑菌圈半徑分別為12.3，mm和12.7，mm.將植物乳桿菌TK9和IMAU80134應用于饅頭和酸奶的防腐模擬實驗，植物乳桿菌TK9可分別將饅頭和酸奶的保質(zhì)期延長1，d和4，d，菌株IMAU80134可分別將饅頭和酸奶的保質(zhì)期延長3，d和4，d.

植物乳桿菌；抗真菌；生物防腐

霉菌引起的食品腐敗可以造成巨額的經(jīng)濟損失，霉菌產(chǎn)生的毒素會危及人們的健康與生命安全［1］.對于食品行業(yè)來說，食品安全與衛(wèi)生問題是其發(fā)展的關(guān)鍵問題之一.以前，人們常用一些物理方法和添加化學防腐劑防止食品腐敗變質(zhì)和延長食品的貨架期.但物理方法存在使用范圍窄、能耗大、設(shè)備造價高等缺點而難以廣泛推廣；化學防腐劑又存在著安全隱患，長期食用會危害人體健康，且許多腐敗菌已對化學防腐劑產(chǎn)生抗性.隨著人們生活水平的提高，人們對食品的要求已不僅僅滿足于傳統(tǒng)意義上的色、香、味，更注重于食品的天然、安全、無殘留化學制劑.而生物防腐保鮮因其天然、高效、無毒或低毒以及不破壞食品的原有風味等顯著特性，目前已成為國際食品添加劑市場的新寵［2-4］.

乳酸菌作為益生菌，是公認的安全級（generally recognized as safe，GRAS）菌株.它分泌的一些代謝產(chǎn)物可以抑制某些細菌及真菌的生長.此外，乳酸菌還具有與霉菌毒素結(jié)合的能力，可見乳酸菌及其代謝產(chǎn)物在生物防腐領(lǐng)域具有很好的應用潛力［5］.Sathe等［6］將一定細胞濃度的植物乳桿菌和一定濃度的腐敗真菌孢子懸液噴灑在黃瓜的傷口上，對照只加病原菌或只加植物乳桿菌，結(jié)果噴有植物乳桿菌的黃瓜的保質(zhì)期明顯延長.Lan等［7］向葡萄表面噴灑一定濃度的乳酸菌發(fā)酵液，能使表面含有草酸青霉的葡萄的保質(zhì)期延長 6，d.Muhialdin等［8］從食物中篩選出 4株具有抗真菌活性的乳酸菌，實驗證明所篩選出的菌株的上清液可使乳酪的保質(zhì)期在4，℃時延長19～29，d，在 20～30，℃時延長 6～12，d.本實驗分別以婁地青霉和黃曲霉為指示菌，篩選出兩株抑菌能力較強的植物乳桿菌，并研究了這兩株對其他霉菌的抑制活性和這兩株菌在饅頭和酸奶中的防腐效果.

1 材料與方法

1.1 菌種與供試食物

140株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）來自內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學“乳品生物技術(shù)與工程”教育部重點實驗室；L.，plantarum TK9 是本實驗室從內(nèi)蒙古地區(qū)傳統(tǒng)自然發(fā)酵酸粥中篩選獲得.婁地青霉菌（Penicillium roqueforti）購于中國普通微生物菌種保藏中心.黃曲霉（Aspergillus flavus）由天津科技大學生化工程研究室保存.柑橘青霉（Penicillium citrinum）來自浙江大學生物技術(shù)研究所.草酸青霉（Penicillium oxalicum）從腐爛的蘋果中分離獲得.煙曲霉（Aspergillus fumigatus）由天津科技大學工業(yè)發(fā)酵微生物重點實驗室篩選保藏.

供試食物純牛奶和酸奶購于超市.

1.2 培養(yǎng)基

乳酸菌活化培養(yǎng)基采用 MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10，g、牛肉膏10，g、酵母膏5，g、KH2PO42，g、檸檬酸三銨 2，g、乙酸鈉 2，g、葡萄糖 20，g、吐溫 80 1，mL、MgSO4·7H2O 0.5，g、MnSO4·4H2O 0.25，g、固體瓊脂20，g、蒸餾水1，L，pH 6.5，115，℃滅菌20，min.

酸粥中乳酸菌篩選培養(yǎng)基：含有 1% CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基.

真菌培養(yǎng)基采用 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯洗凈去皮，稱取200，g切成小塊，加水煮爛（煮沸30，min，能被玻璃棒戳破即可），用四層紗布過濾，加入 20，g葡萄糖和瓊脂（制備半固體培養(yǎng)基加入 8，g瓊脂，制備固體培養(yǎng)基加入 20，g瓊脂），繼續(xù)加熱攬拌混勻，稍冷卻后再補足水分至 1，000，mL，分裝于試管或者錐形瓶，121，℃滅菌 20，min后取出試管擺斜面或者搖勾，冷卻后保存?zhèn)溆?

1.3 植物乳桿菌培養(yǎng)和指示菌霉菌孢子懸液的制備

1.3.1 菌株活化

取少量保存于體積分數(shù)為 30%甘油溶液內(nèi)的植物乳桿菌于 MRS瓊脂平板上劃線，挑取單菌落用MRS固體斜面培養(yǎng)基進行菌種活化傳代，從活化的MRS固體斜面培養(yǎng)基上挑取適量菌體接入 MRS液體培養(yǎng)基中，37，℃靜置培養(yǎng)12，h.

1.3.2 植物乳桿菌發(fā)酵液的制備

從活化的種子液中按 5%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，37，℃恒溫培養(yǎng)48，h后即得到乳酸菌發(fā)酵液. 1.3.3 指示菌霉菌孢子懸液的制備

將接種霉菌的PDA斜面培養(yǎng)1周，用無菌水洗下孢子，3層擦鏡紙過濾除去菌絲得到孢子懸液.用血球記數(shù)板進行計數(shù)，確定孢子懸液的濃度.

1.4 抑菌活性檢測方法

1.4.1 雙層平板點接法

吸取乳酸菌發(fā)酵液5，μL點在MRS固體平板中央，37，℃培養(yǎng) 48，h后，在平板上輕輕傾倒10，mL含有霉菌孢子 104，mL-1的 PDA培養(yǎng)基，28，℃培養(yǎng)48，h，測量抑菌圈半徑，每個樣品重復測定3次.

1.4.2 牛津杯法

將 37，℃培養(yǎng) 48，h的乳酸菌發(fā)酵液 8，000，r/min離心去除菌體，上清液冷凍干燥后，懸浮在無菌水中，濃縮到原始濃度的 15倍.用含有霉菌孢子104，mL-1的 10，mL PDA倒平板，待其凝固后放上滅過菌的牛津杯，向牛津杯中加入 150，μL待測上清濃縮液.28，℃培養(yǎng) 48，h，測量抑菌圈半徑，每個樣品重復測定3次.

1.5 乳酸菌的應用實驗

1.5.1 應用于饅頭的防腐實驗［9］

（1）酸面團發(fā)酵劑的制備：在 MRS培養(yǎng)基中將活化后的所篩選出的抗真菌乳酸菌菌種培養(yǎng)至對數(shù)后期，取菌液于8，000，r/min離心5，min得到菌泥.將菌泥（108，g-1）和酵母（1，g/100，g）接種到等比例混合的面粉和無菌水中，攪拌混勻，對照只接種酵母（1，g/100，g），放入37，℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)酵至pH為 4.0.待發(fā)酵完成后將酸面團灌入無菌培養(yǎng)皿中，厚度為1.0，cm，于-70，℃預凍4，h后，冷凍干燥機凍干約24，h.

（2）饅頭的制作：稱取面粉 45.5，g、水 40，mL、酵母0.9，g和抗真菌乳酸菌凍干發(fā)酵劑4.5，g，對照稱取面粉 50，g、水 40，mL、酵母 0.9，g，和面至面團表面光滑，成形的面團于 37，℃、相對濕度 85%發(fā)酵至原來大小的 2～2.5倍取出，滾圓，蒙保鮮膜松弛 15，min左右，將松弛好的面團于蒸鍋沸水蒸制30，min.

（3）防腐實驗：饅頭蒸好以后，放入無菌的鋼桶中，冷卻，于無菌超凈工作臺上將其切成片，并向饅頭切片表面噴灑 1.5，mL婁地青霉孢子懸液（濃度為102，mL-1）.將其裝到塑料袋中，密封，每隔約 2，d向里面稍微灑一次無菌水，保證其濕度，室溫放置，觀察霉菌開始生長的時間.

1.5.2 應用于酸奶的防腐實驗

準備 100，mL純牛奶，倒入滅菌的三角瓶內(nèi)，加入 10，mL純酸奶（只含保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌）.輔助發(fā)酵劑所篩選出的抗真菌乳酸菌添加量為5%，不加輔助發(fā)酵劑的作為空白對照，攪拌后取20，mL注入滅過菌的培養(yǎng)皿，于42，℃發(fā)酵約12，h.向發(fā)酵好的酸奶表面噴灑黃曲霉孢子懸液（濃度為103，mL-1），每天觀察酸奶表面霉菌的生長狀況.

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種篩選

2.1.1 抗婁地青霉乳酸菌的篩選

采用雙層平板點接法來挑選對婁地青霉有抑制能力的菌株.如果在乳酸菌菌落周圍有透明的抑菌圈，說明其有抗真菌能力，抑菌圈的大小在一定程度上反映抑菌能力的大小.供試的 140株植物乳桿菌中，抑菌圈半徑＞9，mm有20株.將所篩選的20株植物乳桿菌用牛津杯法進行復篩，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌IMAU80134對婁地青霉的抑菌效果最好，其抑菌圈半徑達到8.4，mm.圖1為除IMAU80134外的另外19株菌中的3株與IMAU 80134的比較結(jié)果.

圖1 部分乳酸菌對婁地青霉的抑菌活性Fig. 1 Antifungal activity of LAB strains against P. ，roqueforti

2.1.2 酸粥中抗黃曲霉乳酸菌的篩選

吸取1，mL菌液，注入9，mL生理鹽水中，依次進行10倍梯度的稀釋，取2個稀釋梯度10-3、10-4稀釋液，分別取0.1，mL涂布于MRS培養(yǎng)基上，37，℃培養(yǎng)36～48，h后，隨機挑取溶鈣圈大且符合乳酸菌菌落形態(tài)特征的單菌落，鏡檢后在 MRS 固體培養(yǎng)基上反復劃線進行純化，直至顯微鏡下的菌株形態(tài)特征一致，得到TK9、TKA2、TKA3、TKB1、TKB2、TKC1、TKC2、TKC3、TKD1、TKD2.針對這幾株菌用雙層平板點接法檢測其抑制黃曲霉的效果，其中抑菌圈半徑＞9，mm的是菌株TK9、TKC1，7～9，mm的是菌株TKA2、TKB2，1～7，mm的是菌株 TKB1、TKC3、TKA3、TKD2、TKC2、TKD1.

由此得到 2株抑菌效果較好的乳酸菌 TK9和TKC1，經(jīng) 16S rDNA方法鑒定TK9也為植物乳桿菌.

2.2 植物乳桿菌IMAU80134和TK9的抑菌譜

植物乳桿菌IMAU80134和TK9對霉菌的抑制效果如圖2所示.由圖2可知：植物乳桿菌TK9與IMAU80134除了分別對黃曲霉和婁地青霉有抑制活性外，對所提供的其他指示菌也有抑菌活性.其中對草酸青霉的抑菌活性最好，植物乳桿菌 TK9和IMAU80134的抑菌圈半徑分別為 12.3，mm 和12.7，mm；對柑橘青霉的抑菌活性最差，抑菌圈半徑分別為4.6，mm和4.3，mm.同種植物乳桿菌對不同的霉菌的抑制效果不同；針對相同的指示菌時，不同的植物乳桿菌的抑制效果也不同.

圖2 植物乳桿菌對霉菌的抑制效果Fig. 2 Antifungal activity of L.， plantarum against mould

2.3 乳酸菌的防腐實驗結(jié)果

食物若在存儲過程中感染真菌并進一步產(chǎn)生真菌毒素會對人類健康造成很大的危害.將乳酸菌作為防腐劑應用于食物，可以有效抑制真菌的生長并延長保質(zhì)期.雖然目前已有很多關(guān)于抗真菌的乳酸菌及其抑菌物質(zhì)特性的研究，但它們的抗真菌活性大多是在實驗室條件下被檢測出來的，如本實驗的前半部分.由于環(huán)境、菌體生長基質(zhì)不同等原因，若將其應用食品中不一定能夠檢測到抗真菌活性.如Rosenquist 等［10］通過agar spot assays篩選出的具有強抑菌活性的乳酸菌在面團中就不能表現(xiàn)出同樣的效果.本實驗以婁地青霉和黃曲霉為指示菌，檢測植物乳桿菌TK9和IMAU80134是否有作為生物防腐劑的潛能.

2.3.1 應用于饅頭中的生物防腐實驗

婁地青霉是面包中最常見的腐敗真菌，而饅頭與面包的配料相似，所以以婁地青霉為指示菌，研究植物乳桿菌對自制饅頭的防腐效果，結(jié)果如圖 3所示.由圖3可以看出：第3天對照組表面孢子開始萌發(fā)，而加入植物乳桿菌 TK9的實驗組在第 4天也跟著萌發(fā)，加入植物乳桿菌IMAU80134的實驗組在第6 天才開始萌發(fā).

圖3 乳酸菌作為防腐劑在饅頭中的應用情況Fig. 3 Evaluation of bio-protection effects on Chinese steamed bread

近年來，有不少關(guān)于植物乳桿菌延緩面包腐敗的研究，如與只接種酵母的面包相比，接種有植物乳桿菌 FST 1.7和酵母的酸面團面包，其表面腐敗真菌Fusarium culmorum和Fusarium graminearum的生長速度明顯變緩［11］.與普通面包相比，用 L.，plantarum CRL 778和酵母制作的酸面團面包使面包表面的黃曲霉孢子延緩了 5，d萌發(fā)［9］.本實驗中的兩株植物乳桿菌雖然不能讓婁地青霉孢子延緩5，d萌發(fā)，但與對照相比，仍具有延長饅頭保質(zhì)期進而作為生物防腐劑的潛能.

2.3.2 應用于酸奶中的生物防腐實驗

酸奶由于含有豐富的營養(yǎng)成分，極易被雜菌污染，再加上相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)設(shè)備、加工環(huán)境衛(wèi)生狀況等問題，會導致酸奶保質(zhì)期內(nèi)出現(xiàn)變質(zhì)現(xiàn)象，而酸奶的變質(zhì)主要是由微生物引起的.由于霉菌最適生長 pH為 3.8～6.0，與酸奶的 pH 4.2～4.7 相近，所以霉菌是酸奶的主要污染物之一［12］.利用具有抗真菌活性的乳酸菌來發(fā)酵生產(chǎn)酸奶達到延長酸奶本身的保質(zhì)期也是目前的一個研究方向.如李紅娟［13］將Lactobacillus casei AST18作為輔助發(fā)酵劑添加到酸奶中，28，℃貯藏時，可將酸奶的保質(zhì)期延長 4，d.本實驗將植物乳桿菌TK9和IMAU80134作為輔助發(fā)酵劑應用到酸奶中，觀察其抑菌狀況.

乳酸菌應用于酸奶的生物防腐實驗結(jié)果如圖 4所示，指示菌為黃曲霉.由圖4可知：第2天，空白對照表面開始出現(xiàn)霉菌污染情況，接有植物乳桿菌TK9和 IMAU134，酸乳表面無明顯變化；直到第 6天，接有植物乳桿菌TK9和IMAU80134菌的酸乳表面才開始出現(xiàn)雜菌污染狀況.兩株植物乳桿菌之所以能抑制酸奶中黃曲霉的生長，原因可能是植物乳桿菌能產(chǎn)生一些具有抑菌作用的活性物質(zhì)，如乳酸、醋酸、丙酸、過氧化氫、羥基脂肪酸和肽類物質(zhì)等［5，14］.

圖4 乳酸菌作為防腐劑在酸奶中的應用情況Fig. 4 Evaluation of bio-protection effects on yoghourt

3 結(jié) 語

本實驗以婁地青霉為指示菌，從140株植物乳桿菌中篩選出一株抗婁地青霉活性較高的菌株IMAU80134；以黃曲霉為指示菌從酸粥中篩選出一株抗黃曲霉活性較高的植物乳桿菌 TK9.這兩株菌除了分別對黃曲霉和婁地青霉有抑制作用外，對煙曲霉、草酸青霉和柑橘青霉也有抑菌作用.將植物乳桿菌IMAU80134和TK9應用于饅頭和酸奶的模擬生物防腐實驗，菌株IMAU80134可分別將饅頭和酸奶的保質(zhì)期延長3，d和4，d，植物乳桿菌TK9可分別將饅頭和酸奶的保質(zhì)期延長1，d和4，d.

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抗真菌乳酸菌的篩選及其對饅頭和酸奶的防腐實驗

王應東，陳 沖，王海寬

Screening of Antifungal Lactic Acid Bacteria and its Application in Chinese Steamed Bread and Yogurt

WANG Yingdong，CHEN Chong，WANG Haikuan
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）

With the overlay method，the strain IMAU80134 with a high antifungal activity against Penicillium roqueforti was screened from 140 Lactobacillus plantarum . Lactobacillus plantarum TK9 isolated from acid gruel displayed a high antifungal activity against Aspergillus flavus. The broad spectrum of antifungal activity of the 2 colonies indicated that both L. plantarum TK9 and IMAU80134 could inhibit Penicillium citrinum，Penicillium oxalicum and Aspergillus fumigatus，in addition to A. flavus and P. roqueforti. L. plantarum TK9 and IMAU80134 had stronger antifungal activity against P. oxalicum，The inhibition zone radii were 12.3 mm and 12.7 mm respectively. Meanwhile，both L. plantarum TK9 and IMAU80134 were applied to the bio-preservation of Chinese steamed bread and yoghurt in vitro simulation experiments.Their shelf-life could be extended 1 and 4 days respectively by L. plantarum TK9，3 and 4 days respectively by L. plantarum IMAU80134.

Lactobacillus plantarum；antifungal activity；bio-preservation

Q93 文獻標志碼：A 文章編號：1672-6510（2015）02-0011-05

10.13364/j.issn.1672-6510.20140058

2014-04-15；

2014-07-12

國家自然科學基金資助項目（30900961）；乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室開放課題基金資助項目

王應東（1989—），男，陜西人，碩士研究生；通信作者：王海寬，教授，hkwang@aliyun.com.

周建軍