IrrE重組大腸桿菌的構(gòu)建和性能分析

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

利用 pET-28a（+）質(zhì)粒將來源于耐輻射異常球菌（Deinococcus radiodurans）R1的 irrE基因在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中進(jìn)行異源表達(dá)，在IPTG終濃度 2，mmol/L、誘導(dǎo)溫度37，℃、誘導(dǎo)培養(yǎng)6，h條件下進(jìn)行了蛋白誘導(dǎo).進(jìn)一步考察 IrrE異源表達(dá)對(duì)大腸桿菌生長性能和耐受能力的影響，結(jié)果表明：IrrE的表達(dá)能夠提高大腸桿菌正常條件下的生長速率和最終生物量；同時(shí)，能夠不同程度提高大腸桿菌在壓力沖擊下的存活能力，其中，高滲條件下存活能力的提高最為明顯.而重組菌株在壓力沖擊下的生長速率和最終生物量均明顯高于對(duì)照菌株.這說明 IrrE在提高大腸桿菌的壓力耐受性方面表現(xiàn)出良好的效果.

IrrE；大腸桿菌；異源表達(dá)；全局轉(zhuǎn)錄；耐受性

采用微生物細(xì)胞工廠生產(chǎn)各種化學(xué)品的過程中，有機(jī)化學(xué)品產(chǎn)物或有害的環(huán)境（高溫和低溫、極端pH、滲透壓、營養(yǎng)饑餓、有害的底物、有毒的污染物、高濃度的代謝產(chǎn)物或者副產(chǎn)物等）往往會(huì)對(duì)微生物細(xì)胞或胞內(nèi)酶產(chǎn)生嚴(yán)重的毒害效應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡或酶催化劑失活，進(jìn)而嚴(yán)重影響生物催化轉(zhuǎn)化過程的生產(chǎn)效能.因此，越來越多的研究者開始關(guān)注如何獲得滿足各種工業(yè)應(yīng)用屬性的微生物菌種.與自然分離的方法相比，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)微生物進(jìn)行遺傳改造是提高其環(huán)境耐受性的更為有效方法［1］.

近年來，單個(gè)外源與抗逆性相關(guān)基因的異源表達(dá)已成為提高宿主微生物耐受性的重要途徑［2-3］.但生物的代謝途徑呈網(wǎng)絡(luò)體系，細(xì)胞表型與基因之間并非簡單的線性對(duì)應(yīng)關(guān)系，細(xì)胞的耐受性往往由多個(gè)基因共同控制.因此，單個(gè)或幾個(gè)基因的改造和修飾對(duì)于目標(biāo)表型整體水平上的提高表現(xiàn)出一定的局限性［4-5］.2006年，美國麻省理工學(xué)院的Alper等［6］提出了全局轉(zhuǎn)錄機(jī)制工程（也稱全轉(zhuǎn)錄工程，global transcription machinery engineering，gTME）的概念，該技術(shù)通過基因工程方法改造全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子使得整個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程發(fā)生變化，是一種在整體水平上改變細(xì)胞基因組轉(zhuǎn)錄，獲得有益細(xì)胞表型的全新的定向進(jìn)化方法.

IrrE是來源于耐輻射異常球菌（Deinococcus radiodurans）R1的一個(gè)全局轉(zhuǎn)錄因子.2010年，Ying等［7］將耐輻射異常球菌中的 irrE基因在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis）異源表達(dá)，有效地提高了微生物對(duì)乙醇、酸、滲透壓和熱沖擊等多重壓力的耐受性，使得菌種在發(fā)酵過程高醇和高酸的壓力下仍然保持旺盛的生長和代謝活力，乙醇產(chǎn)量達(dá)到 14.59，g/L，比改造前菌株的生產(chǎn)能力提高了 66.7%.同年，高加旺等［8］利用穿梭質(zhì)粒pRADZ3將irrE轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌中進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá).對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期內(nèi)重組菌對(duì)H2O2氧化壓力的耐受能力分別提高了10%和7%，紫外線輻照下的存活率提高2倍左右.這些結(jié)果表明，IrrE作為一個(gè)全局轉(zhuǎn)錄因子在微生物耐受性表型的定向進(jìn)化中表現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用潛力.

本文利用pET-28a（+）質(zhì)粒將來源于耐輻射異常球菌（D.，radiodurans）R1的 irrE基因在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中進(jìn)行異源表達(dá)，通過調(diào)整 IPTG濃度和誘導(dǎo)溫度等參數(shù)對(duì)誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化.考察了 IrrE異源表達(dá)對(duì)大腸桿菌生長性能及其對(duì)各種條件耐受能力的影響.該工作為深入研究全局轉(zhuǎn)錄因子 IrrE在微生物耐受性表型定向進(jìn)化中的作用奠定了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）由本研究室保存；耐輻射異常球菌（Deinococcus radiodurans）R1購買自普通微生物菌種保藏中心.

質(zhì)粒pET-28a（+）由本研究室保存.

1.1.2 主要試劑和工具酶

限制性內(nèi)切酶 NcoI、EcoRI，Takara公司；HiFi DNA Polymerase；T4連接酶，Promega公司；卡那霉素、IPTG，生工生物工程（上海）股份有限公司.

蛋白電泳主要溶液、蛋白上樣緩沖液等均按Takara公司商品說明書配制.

SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司；Easy Pure plasmid Miniprep Kit，TransGen Biotech；柱式 DNA膠回收試劑盒，北京天恩澤基因科技有限公司；Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒（可溶型蛋白），康為世紀(jì)公司.

1.1.3 培養(yǎng)基

LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10、酵母浸出粉5、NaCl 5，pH 7.0.

LA培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨 10、酵母浸出粉 5、NaCl 5、瓊脂粉20，pH 7.0～7.2.

1.2 方法

1.2.1 IrrE重組大腸桿菌的構(gòu)建

從NCBI中獲得irrE基因的序列信息，由Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物 P1：TGCCATGGAAATGCCCAGTG CCAACGTC和P2：TCGAATTCCTGTGCAGCGTCC TGCGG（下劃線部分分別為NcoI和EcoRI的酶切位點(diǎn)）.以耐輻射異常球菌 R1總 DNA為模板，使用HiFi DNA Polymerase酶進(jìn)行PCR（擴(kuò)增條件：94，℃預(yù)變性 5，min，94，℃變性 30，s，63，℃退火 30，s，72，℃延伸1，min，30個(gè)循環(huán)，72，℃延伸10，min）.擴(kuò)增得到的irrE用NcoI和EcoRI雙酶切后插入pET-28a（+）的NcoI和EcoRI位點(diǎn)之間，采用熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21，通過菌液PCR（菌液擴(kuò)增條件：94，℃預(yù)變性10，min，94，℃變性30，s，55，℃退火30，s，72，℃延伸1，min，30個(gè)循環(huán)，72，℃延伸10，min）和測序?qū)rrE重組大腸桿菌進(jìn)行篩選和鑒定.

1.2.2 IrrE在大腸桿菌中的表達(dá)條件的優(yōu)化

將重組菌 E. coli BL21（DE3）/pET-28a（+）-irrE和含有空質(zhì)粒的E.，coli BL21（DE3）/pET-28a（+）（對(duì)照菌株）分別接種于50，mL含有卡那霉素（50，μg/mL）的 LB液體培養(yǎng)基中，37，℃、180，r/min振蕩過夜培養(yǎng).以 1%接種量接入 50，mL 含有卡那霉素（50，μg/mL）的LB培養(yǎng)液中，37，℃、180，r/min培養(yǎng)至A600約為 0.6，加入不同終濃度的 IPTG，在不同溫度下誘導(dǎo)6，h，6，000，r/min離心5，min收集適量菌體，加入蛋白上樣緩沖液，沸水浴 5，min，10，000，r/min離心5，min后取上清液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳.

1.2.3 IrrE表達(dá)對(duì)大腸桿菌生長特性的影響

挑取 IrrE重組大腸桿菌和含有空質(zhì)粒的 E.，coli BL21（DE3）/pET-28a（+）（對(duì)照菌株）分別接種于50，mL含有卡那霉素（50，μg/mL）的 LB液體培養(yǎng)基中，37，℃、180，r/min振蕩過夜培養(yǎng)，將兩個(gè)菌的培養(yǎng)液 A600調(diào)為相同，然后以 0.5%接種量轉(zhuǎn)接到新鮮的含有2，mmol/L IPTG、50，μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37，℃、180，r/min振蕩培養(yǎng)，每間隔 2，h取樣測定A600，繪制生長曲線.

1.2.4 IrrE表達(dá)對(duì)大腸桿菌壓力耐受能力的影響

將 IrrE重組大腸桿菌和含有空質(zhì)粒的 E.，coli BL21（DE3）/pET-28a（+）（對(duì)照菌株）分別接種于50，mL含有卡那霉素（50，μg/mL）的 LB液體培養(yǎng)基中，37，℃、180，r/min振蕩過夜培養(yǎng).以 1%接種量接入 50，mL含有卡那霉素（50，μg/mL）的 LB液體培養(yǎng)基中，37，℃、180，r/min培養(yǎng)至A600約為0.6，此時(shí)，加入終濃度為 2，mmol/L的 IPTG，37，℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)6，h.取1，mL培養(yǎng)液，6，000，r/min離心10，min收集菌體，將兩個(gè)菌的菌體質(zhì)量調(diào)為相同后分別轉(zhuǎn)接到50，mL含有不同壓力沖擊條件（3，mol/L山梨醇、極端pH 2或12、體積分?jǐn)?shù)10%甲醇、體積分?jǐn)?shù)12%乙醇、體積分?jǐn)?shù) 1%H2O2）和卡那霉素（50，μg/mL）的 LB培養(yǎng)基中沖擊30，min.沖擊后的培養(yǎng)液采用10倍逐級(jí)稀釋法在含卡那霉素（50，μg/mL）的 LA平板上進(jìn)行涂布，37，℃培養(yǎng) 16，h后觀察不同稀釋度下平板上的菌落數(shù)量，按照式（1）計(jì)算存活率.

挑取IrrE重組大腸桿菌和含有空質(zhì)粒的E.，coli BL21（DE3）/pET-28a（+）（對(duì)照菌株）分別接種于50，mL含有卡那霉素（50，μg/mL）的 LB液體培養(yǎng)基中，37，℃、180，r/min振蕩過夜培養(yǎng)，將兩個(gè)菌的培養(yǎng)液 A600值調(diào)為相同，以 0.5%接種量分別轉(zhuǎn)接到新鮮的含有2，mmol/L IPTG、50，μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，向培養(yǎng)基中分別加入終濃度為 1，mol/L的山梨醇溶液、4%乙醇和 5%甲醇繼續(xù)培養(yǎng)，37，℃、180，r/min振蕩培養(yǎng)，每間隔2，h取樣測定A600值，繪制生長曲線，考察不同壓力沖擊條件下野生型 IrrE重組大腸桿菌的生長能力.

2 結(jié)果與討論

2.1 IrrE重組大腸桿菌的構(gòu)建

以 pET-28a（+）載體上的通用引物 T7/T7ter進(jìn)行菌液 PCR驗(yàn)證，篩選陽性克隆，結(jié)果如圖 1所示.由圖 1可知：電泳條帶約 1，200，bp，與預(yù)計(jì)大小相符.將該陽性克隆中的質(zhì)粒重提后進(jìn)行測序，測得的序列信息與GenBank（登錄號(hào)AE000513）中發(fā)表的耐輻射異常球菌（Deinococcus radiodurans）R1來源的 irrE基因（DR0167）［8］進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示具有99%同源性，說明IrrE重組大腸桿菌構(gòu)建成功.

圖1 E.，coli BL21（DE3）/pET-28a（+）-irrE的菌液PCR結(jié)果Fig. 1 PCR products of E.，coli BL21（DE3）/pET-28a（+）-irrE

2.2 IrrE在大腸桿菌中的表達(dá)條件的優(yōu)化

將含有重組質(zhì)粒 pET-28a（+）-irrE的 E.，coli BL21（DE3）菌株在不同的條件下進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，收集細(xì)胞，制備蛋白樣品.利用SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果如圖2所示.

圖2 E.，coli BL21（DE3）/pET-28a（+）-irrE和E.，coli BL21（DE3）/pET-28a（+）的蛋白電泳圖Fig. 2 The SDS-PAGE of E.，coli BL21（DE3）/pET-28a（+）-irrE and E.，coli BL21（DE3）/pET-28a（+）

由圖2可知：不同濃度的IPTG均能夠誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)，當(dāng)IPTG濃度達(dá)到2，mmol/L，37，℃培養(yǎng)6，h時(shí)，目的蛋白的可溶性表達(dá)最為明顯.因此，確定IrrE蛋白的最佳誘導(dǎo)條件為IPTG終濃度2，mmol/L、誘導(dǎo)溫度37，℃、誘導(dǎo)時(shí)間6，h.

2.3 IrrE表達(dá)對(duì)大腸桿菌生長特性的影響

在不添加壓力的培養(yǎng)基中IrrE重組大腸桿菌和對(duì)照菌的生長曲線如圖 3所示.在不添加壓力的培養(yǎng)基中，野生型IrrE重組大腸桿菌和對(duì)照菌株在8，h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)期，14，h時(shí)開始進(jìn)入穩(wěn)定期.兩個(gè)菌株的生長階段的劃分情況基本一致，但是 IrrE重組大腸桿菌的生長速率和最終生物量均高于對(duì)照菌株.這說明IrrE的表達(dá)能夠提高大腸桿菌的生長特性.

圖3 IrrE重組大腸桿菌和對(duì)照菌的生長曲線Fig. 3 Growth curves of recombinant strain E.，coliandthe control strain E. coli

2.4 IrrE表達(dá)對(duì)大腸桿菌壓力耐受能力的影響

2.4.1 IrrE表達(dá)對(duì)大腸桿菌壓力沖擊條件下存活情況的影響

各種壓力沖擊下 IrrE重組大腸桿菌和對(duì)照菌的存活情況如圖 4所示.IrrE重組大腸桿菌在 1% H2O2、極端pH、12%乙醇這3種壓力沖擊下的存活率差別不大，在 10%左右波動(dòng)，但均高于對(duì)照菌株.在10%甲醇和 3，mol/L山梨醇的壓力沖擊下，IrrE重組大腸桿菌存活率分別為 37.5%和 44.9%，比對(duì)照菌分別提高了5%和10%左右.以上結(jié)果說明IrrE的表達(dá)能夠不同程度地提高大腸桿菌在壓力沖擊下的存活能力.

圖4 各種壓力沖擊下 IrrE 重組大腸桿菌和對(duì)照菌的存活情況Fig. 4 Cell viability of recombinant strain E.，coliand the control strain E.，coli under various kinds of stress shock

2.4.2 IrrE表達(dá)對(duì)大腸桿菌壓力沖擊條件下生長情況的影響

IrrE重組大腸桿菌和對(duì)照菌在不同壓力沖擊條件下的生長曲線如圖5所示.在4%乙醇?jí)毫_擊條件下 IrrE重組大腸桿菌和對(duì)照菌株的適應(yīng)期約為10，h，而在5%甲醇和1，mol/L山梨醇的壓力沖擊條件下，兩個(gè)菌株的適應(yīng)期為 8，h，表現(xiàn)出更好的適應(yīng)能力.3種壓力沖擊條件下，IrrE重組菌株的生長速率和最終生物量均明顯高于對(duì)照菌株.其中，在1mol/L山梨醇條件下，IrrE重組菌株進(jìn)入穩(wěn)定期后的A600達(dá)到1.70左右，比對(duì)照菌株提高了21%.這說明IrrE的表達(dá)能夠有效提高大腸桿菌對(duì)有機(jī)溶劑和滲透壓這兩種壓力的耐受性.

圖5 IrrE重組大腸桿菌和對(duì)照菌在不同壓力沖擊下的生長曲線Fig. 5 Growth curves of recombinant strain E.，coliand the control strain E.，coli under various kinds of stress

3 結(jié) 語

本文將來源于耐輻射異常球菌（Deinococcus radiodurans）R1的 irrE基因在模式微生物大腸桿菌（E.，coli）中進(jìn)行異源表達(dá)，分析了 IrrE表達(dá)對(duì)大腸桿菌不同壓力耐受能力的影響.結(jié)果表明 IrrE能夠不同程度地提高大腸桿菌在 3，mol/L山梨醇、pH=2、pH=12、10%甲醇、12%乙醇和1%H2O2壓力沖擊下的存活能力，同時(shí)改善大腸桿菌在 4%乙醇、5%甲醇及1，mol/L山梨醇?jí)毫ο碌纳L情況.這些結(jié)果表明，IrrE在微生物復(fù)雜表型的定向進(jìn)化方面表現(xiàn)出良好的效果.

［1］ Nicolaou S A，Gaida S M，Papoutsakis E T. A comparative view of metabolite and substrate stress and tolerance in microbial bioprocessing：From biofuels and chemicals，to biocatalysis and bioremediation［J］. Metabolic Engineering，2010，12（4）：307-331.

［2］ 劉瑞杰，陳婷，曹軍衛(wèi). 滲透壓調(diào)節(jié)基因proBA的融合表達(dá)對(duì)大腸桿菌耐高滲脅迫能力的影響［J］. 微生物學(xué)報(bào)，2005，45（1）：23-26.

［3］ Mahin A A，Sugimoto S，Higashi C，et al. Improvement of multiple-stress tolerance and lactic acid production in Lactococcus lactis NZ9000 under conditions of thermal stress by heterologous expression of Escherichia coli dnaK［J］. Applied and Environmental Microbiology，2010，76（13）：4277-4285.

［4］ Alper H，Miyaoku K，Stephanopoulos G，. Construction of lycopene-overproducing E. coli strains by combining systematic and combinatorial gene knockout targets［J］. Nature Biotechnology，2005，23（5）：612-616.

［5］ Alper H，Jin Y S，Moxley J F，et al. Identifying gene targets for the metabolic engineering of lycopene biosynthesis in Escherichia coli［J］. Metabolic Engineering，2005，7（3）：155-164.

［6］ Alper H，Stephanopoulos G，. Global transcription machinery engineering：A new approach for improving cellular phenotype［J］. Metabolic Engineering，2007，9（3）：258-267.

［7］ Ying Z，Ma R Q，Zhao Z L，et al. irrE，an exogenous gene from Deinococcus radiodurans，improves the growth of and ethanol production by a Zymomonas mobilis strain under ethanol and acid stresses［J］. Journal of Microbiology and Biotechnology，2010，20（7）：1156-1162.

［8］ 高家旺，謝水波，唐振平，等. 奇球菌 pprI基因增強(qiáng)枯草芽孢桿菌細(xì)胞抗性的研究［J］. 南華大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，24（1）：78-82.

IrrE重組大腸桿菌的構(gòu)建和性能分析

駱健美，鄭媛媛，王 敏

The Construction of Recombinant Escherichia coli by IrrE and Cell Performance Analysis

LUO Jianmei，ZHENG Yuanyuan，WANG Min
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）

The heterologous expression of irrE，from Deinococcus radiodurans R1，in E. coli BL21（DE3）was carried out using the vector pET-28a（+）. The optimal protein expression conditions of IrrE were as follows.The final concentration of IPTG was 2，mmol/L，and the induction temperature and time were 37，℃ and 6，h，respectively. The influence of IrrE on cell growth and tolerance was further investigated. The results indicated that IrrE could enhance the growth rate and produce more final biomass of Escherichia coli under normal conditions，and improve the survival ability of the cell under stress shock to different extent，especially the tolerance to osmotic shock. The growth rate was higher and significantly morefinal biomasses of the recombinant strain containing pET-28a（+）-irrE under stress were found than in the control strain（harboring the empty vector pET-28a（+））. It can be concluded that the expression of IrrE could enhance the tolerance of E. coli to stress.

IrrE；Escherichia coli；heterologous expression；global transcription；tolerance

Q786 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1672-6510（2015）02-0006-05

10.13364/j.issn.1672-6510.20140064

2014-04-25；

2014-05-27

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（21306138）；天津市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（13JCYBJC20600）

駱健美（1978—），女，湖南人，教授，luojianmei@tust.edu.cn.

周建軍