《有機(jī)酸工藝學(xué)》實(shí)踐教學(xué)綜合性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的設(shè)計(jì)與實(shí)踐

黃國(guó)清 張名愛 于翠芳

摘 要：《有機(jī)酸工藝學(xué)》是一門綜合性很強(qiáng)的專業(yè)課。該文將比較教學(xué)法用于教學(xué)實(shí)習(xí)內(nèi)容的設(shè)計(jì)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)小組選擇不同的離子種類及濃度，使組內(nèi)和組間比較金屬離子濃度和種類對(duì)檸檬酸生成、菌體生長(zhǎng)的影響，并篩選高產(chǎn)酸能力的實(shí)驗(yàn)菌株。對(duì)于加深同學(xué)們對(duì)理論知識(shí)的理解、提高《有機(jī)酸工藝學(xué)》教學(xué)實(shí)習(xí)的效果具有重要意義。

關(guān)鍵詞：有機(jī)酸工藝學(xué)；教學(xué)實(shí)習(xí)；比較教學(xué)法

中圖分類號(hào) G642.0 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2015）14-175-03

《有機(jī)酸工藝學(xué)》教學(xué)改革概述

《有機(jī)酸工藝學(xué)》是一門實(shí)踐性極強(qiáng)、與生產(chǎn)實(shí)際聯(lián)系非常緊密的專業(yè)課，其主要研究有機(jī)酸發(fā)酵的原理、原料、菌種、工藝、技術(shù)以及與之相關(guān)的各種新工藝、新方法，對(duì)于培養(yǎng)學(xué)生掌握利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)有機(jī)酸的科學(xué)原理、實(shí)驗(yàn)技能、科學(xué)研究及實(shí)際動(dòng)手能力非常重要。本門課程是我院生物工程專業(yè)的一門必修課，也是比較有特色的一門課程，目前僅有浙江工商大學(xué)、仲愷農(nóng)學(xué)院和寧夏大學(xué)等少數(shù)幾所院校開設(shè)了本門或相關(guān)的課程。

由于開設(shè)本門課程及相關(guān)課程的院校較少，目前僅有寧夏大學(xué)對(duì)該課程的教學(xué)改革進(jìn)行了研究。寧夏大學(xué)高度重視實(shí)踐性教學(xué)在《有機(jī)酸發(fā)酵工藝學(xué)》課程中的應(yīng)用，提出通過將實(shí)踐性教學(xué)貫穿于課堂教學(xué)、開設(shè)綜合性和設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)、對(duì)本科生開放專業(yè)實(shí)驗(yàn)室、引進(jìn)仿真軟件、建立校外實(shí)踐教學(xué)基地等手段來提高本門課程的教學(xué)效果。研究結(jié)果表明，此舉大大調(diào)動(dòng)了學(xué)生參與實(shí)踐的積極性、主動(dòng)性和學(xué)習(xí)興趣，有效激發(fā)了學(xué)生獨(dú)立思考、靈活運(yùn)用和勇于創(chuàng)新的能力，提高了學(xué)生的綜合素質(zhì)和實(shí)踐技能，有助于將學(xué)生培養(yǎng)成應(yīng)用型、創(chuàng)新型及開拓型人才[1]。

雖然目前對(duì)本門課程進(jìn)行教學(xué)改革研究的報(bào)導(dǎo)較少，但是對(duì)類似課程進(jìn)行教學(xué)改革已有較多報(bào)導(dǎo)。山東師范大學(xué)對(duì)《食品發(fā)酵工藝學(xué)》的教學(xué)改革和實(shí)踐進(jìn)行了研究，提出了在理論教學(xué)中以發(fā)酵產(chǎn)品的共性規(guī)律為主線，并在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中開設(shè)相應(yīng)綜合大實(shí)驗(yàn)的教學(xué)模式；并設(shè)置了學(xué)生主講日，鼓勵(lì)學(xué)生參與創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)來提高本門課程的教學(xué)效果[2]。東北農(nóng)業(yè)大學(xué)對(duì)《果酒加工工藝學(xué)》的教學(xué)方法及教學(xué)手段進(jìn)行了改革，發(fā)現(xiàn)通過改進(jìn)教學(xué)方法、增設(shè)綜合性實(shí)驗(yàn)可顯著提高本門課程的教學(xué)效果和學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣[3]。

由上述研究可知，教學(xué)改革可顯著提高應(yīng)用性課程的教學(xué)效果，而實(shí)踐教學(xué)是教學(xué)改革的重中之重，設(shè)計(jì)合理的綜合性項(xiàng)目可極大的激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)熱情。《有機(jī)酸工藝學(xué)》重點(diǎn)講授的是檸檬酸的發(fā)酵生產(chǎn)，因此設(shè)計(jì)1個(gè)檸檬酸發(fā)酵的綜合性實(shí)驗(yàn)，對(duì)于加深同學(xué)們對(duì)相關(guān)理論和實(shí)踐知識(shí)的理解有重要意義。

多種微生物，包括細(xì)菌[4]、真菌[5]和酵母[6]都能利用不同的底物來發(fā)酵產(chǎn)生檸檬酸，但是黑曲霉（Aspergillus niger）由于其產(chǎn)酸率高、易于處理、能夠利用多種底物等特點(diǎn)，是目前工業(yè)生產(chǎn)上唯一使用的檸檬酸產(chǎn)生菌[7]。液態(tài)發(fā)酵工藝是最常用的檸檬酸發(fā)酵工藝，底物的性質(zhì)對(duì)檸檬酸的產(chǎn)率有重要影響，目前最常用的底物為甜菜糖蜜和甘蔗糖蜜。菌絲體的流變學(xué)特性對(duì)發(fā)酵液的物理性質(zhì)及檸檬酸產(chǎn)率有重要影響，而菌絲體的流變學(xué)特性與生物量的濃度息息相關(guān)[8]。除了上述因素外，檸檬酸的產(chǎn)率還受到諸多因素的影響，其中培養(yǎng)基金屬離子的種類和含量對(duì)檸檬酸合成的影響最大。Zn2+、Mn2+、Fe2+、Cu2+等金屬離子在極低濃度下即會(huì)顯著抑制檸檬酸的生成[7]；金屬離子之間還存在相互作用，在接種時(shí)加入0.1～500mg/kg的Cu2+可拮抗Fe2+對(duì)檸檬酸合成的不利影響[9]。氮源種類對(duì)檸檬酸的合成也有重要影響，銨鹽如尿素、氯化銨、硫酸銨等有利于檸檬酸的合成[10]。另外，攪拌速度[11]、發(fā)酵溫度[12]對(duì)檸檬酸合成也有重要影響。

檸檬酸的分離提取方法有多種，包括鈣鹽沉淀法、溶劑提取法、大孔樹脂吸附法和原位提取法，其中鈣鹽提取法最為常用[7]。檸檬酸的定性分析方法有多種，除了色譜分析法外，根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T8296-2006《檸檬酸》，檸檬酸可以采用物理和化學(xué)的方法進(jìn)行定性分析[13]。

根據(jù)上述國(guó)內(nèi)外的最新研究進(jìn)展，結(jié)合本院實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況，本院現(xiàn)有的《有機(jī)酸工藝學(xué)》教學(xué)實(shí)習(xí)方案采用黑曲霉作為檸檬酸產(chǎn)生菌，主要研究Mn2+濃度（共設(shè)置4個(gè)濃度）對(duì)檸檬酸合成、耗糖速率及生物量的影響，采用鈣鹽法對(duì)檸檬酸進(jìn)行分析純化，并根據(jù)國(guó)標(biāo)的方法對(duì)所得結(jié)晶進(jìn)行定性分析。近幾年來的實(shí)踐結(jié)果表明，所選用的Mn2+濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)和檸檬酸的積累具有顯著影響，實(shí)驗(yàn)效果較為明顯。該綜合項(xiàng)目顯著的促進(jìn)了同學(xué)們對(duì)發(fā)酵工藝原理的理解、培養(yǎng)了同學(xué)們發(fā)酵行業(yè)基本實(shí)驗(yàn)技能，尤其是最后的數(shù)據(jù)處理和討論環(huán)節(jié)加深了同學(xué)們對(duì)《生物化學(xué)》、《發(fā)酵工藝原理》、《生物分離工程》、《微生物學(xué)》等課程的理解和理論知識(shí)的綜合運(yùn)用，受到的同學(xué)們的廣泛好評(píng)。

雖然本門課程的教學(xué)實(shí)踐環(huán)節(jié)取得了較好的教學(xué)效果，但仍存在著研究?jī)?nèi)容略顯單薄、發(fā)酵產(chǎn)酸率低等；此外，本實(shí)習(xí)的發(fā)酵過程均在三角瓶中進(jìn)行，與工業(yè)上常用的深層培養(yǎng)有較大的差別，這在一定程度上影響了實(shí)習(xí)效果。

2 比較教學(xué)法

比較教學(xué)法是指在教學(xué)中將一些具有某種聯(lián)系和區(qū)別的教學(xué)內(nèi)容，放在一起進(jìn)行對(duì)比分析，找出其異同點(diǎn)，使學(xué)生在明確了一個(gè)內(nèi)容之后，能夠自然地聯(lián)想和掌握1另一個(gè)內(nèi)容，并能自行理解，從而達(dá)到預(yù)期的教學(xué)目的。在教學(xué)中采用多種形式的比較，不僅可以把新舊知識(shí)的關(guān)系溝通、組織起來，而且能夠培養(yǎng)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，活躍學(xué)生的思維，弄清各個(gè)現(xiàn)象的本質(zhì)特性，讓學(xué)生更好地掌握知識(shí)。

本項(xiàng)目擬將比較教學(xué)法應(yīng)用于《有機(jī)酸工藝學(xué)》的教學(xué)實(shí)習(xí)，通過改進(jìn)實(shí)驗(yàn)教學(xué)方法和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)使同學(xué)們對(duì)多種不同的結(jié)果進(jìn)行比較，并結(jié)合理論教學(xué)的內(nèi)容對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，這對(duì)于促進(jìn)《有機(jī)酸工藝學(xué)》的教學(xué)效果、加深同學(xué)們對(duì)發(fā)酵工業(yè)的理解、增強(qiáng)同學(xué)們綜合運(yùn)用知識(shí)的能力具有重要意義。

3 研究?jī)?nèi)容

本門課程的教學(xué)實(shí)踐階段目前采用的是一個(gè)綜合實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，要求同學(xué)們研究Mn2+濃度（該金屬離子是影響檸檬酸發(fā)酵的關(guān)鍵因素之一）對(duì)檸檬酸產(chǎn)率、菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)酸速率及糖酸轉(zhuǎn)化率的影響，涉及到的實(shí)驗(yàn)技術(shù)包括殘?zhí)呛繙y(cè)定、總酸測(cè)定、生物量的測(cè)定、檸檬酸的結(jié)晶分離純化及定性分析等技術(shù)。教學(xué)效果表明，Mn2+濃度對(duì)菌體生產(chǎn)、產(chǎn)酸率及糖酸轉(zhuǎn)化率有顯著的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為直觀。通過此次教學(xué)實(shí)踐，同學(xué)們掌握了殘?zhí)菧y(cè)定、生物量測(cè)定及結(jié)晶分離純化等基本實(shí)驗(yàn)技能，了解了發(fā)酵過程監(jiān)控的基本指標(biāo)，初步理解了培養(yǎng)基組成對(duì)發(fā)酵的重要性及其影響目標(biāo)產(chǎn)物合成的途徑，同學(xué)們對(duì)實(shí)習(xí)效果反映良好。但在實(shí)踐過程中也發(fā)現(xiàn)了該實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的研究?jī)?nèi)容較單薄，提供的信息量較少；另外，實(shí)驗(yàn)菌株的產(chǎn)酸能力較差，這在一定程度上影響了教學(xué)實(shí)習(xí)效果。本項(xiàng)目擬通過運(yùn)用比較教學(xué)法和篩選產(chǎn)酸力強(qiáng)的菌株來進(jìn)一步提高實(shí)習(xí)效果。具體的研究?jī)?nèi)容如下：

3.1 比較教學(xué)法的應(yīng)用 黑曲霉發(fā)酵檸檬酸受培養(yǎng)基中金屬離子的影響極大。有些金屬離子對(duì)菌體生長(zhǎng)和檸檬酸的合成均有抑制作用；有些金屬離子對(duì)菌體生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，但會(huì)抑制檸檬酸的積累。金屬離子種類及含量的控制是檸檬酸發(fā)酵成敗的關(guān)鍵。在以往的實(shí)驗(yàn)中只研究了Mn2+對(duì)檸檬酸發(fā)酵及菌絲體的影響，同學(xué)們無法理解其它金屬離子的影響及其作用方式。因此，本項(xiàng)目擬選取多種具有不同作用方式的離子（包括Cu2+、Fe2+、Mn2+、F-、EDTA），要求同學(xué)們分成幾組，每個(gè)組研究某一種離子在不同濃度下對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酸的影響，比較離子濃度的影響；同時(shí)，在數(shù)據(jù)分析中，要求對(duì)不同組之間的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，比較不同金屬離子對(duì)產(chǎn)酸的影響及機(jī)理。同時(shí)，要求新增一組同學(xué)采用實(shí)驗(yàn)室里的2L自動(dòng)發(fā)酵罐進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并與搖瓶發(fā)酵進(jìn)行比較，使同學(xué)們了解發(fā)酵工藝對(duì)產(chǎn)酸、菌體生長(zhǎng)及菌絲球形態(tài)和直徑的影響。該實(shí)習(xí)內(nèi)容設(shè)計(jì)有望使同學(xué)們通過此次教學(xué)獲得大量的信息，通過比較可使同學(xué)們理解離子種類和濃度及發(fā)酵工藝對(duì)產(chǎn)酸的重要影響，從而加強(qiáng)對(duì)發(fā)酵工業(yè)的理解。

3.2 高產(chǎn)檸檬酸黑曲霉菌株的選擇 本實(shí)驗(yàn)室目前采用的黑曲霉不是產(chǎn)檸檬酸專用菌株，產(chǎn)酸率很低，只有1%～2%左右，遠(yuǎn)低于工業(yè)用檸檬酸產(chǎn)生菌的產(chǎn)酸率（15%左右），如此低的產(chǎn)率酸嚴(yán)重影響了發(fā)酵過程中產(chǎn)物的檢測(cè)及實(shí)驗(yàn)效果的觀察，許多指標(biāo)，包括pH值、總酸含量及檸檬酸結(jié)晶等的變化不夠明顯。因此極有必要從各菌種保藏機(jī)構(gòu)購(gòu)買多種檸檬酸高產(chǎn)菌株并對(duì)其產(chǎn)酸性能進(jìn)行比較和篩選，以使實(shí)驗(yàn)效果更加明顯。

4 研究意義

《有機(jī)酸發(fā)酵工藝學(xué)》是生物工程專業(yè)中的一門實(shí)踐性極強(qiáng)、與生產(chǎn)實(shí)際聯(lián)系非常緊密的重要的專業(yè)課程，對(duì)培養(yǎng)學(xué)生掌握利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)有機(jī)酸的科學(xué)原理、實(shí)驗(yàn)技能、科學(xué)研究及實(shí)際動(dòng)手能力非常重要。

本項(xiàng)目順利實(shí)施后，本門課程的綜合實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目設(shè)計(jì)更加合理，不同處理組之間差異更加顯著，實(shí)驗(yàn)效果更加明顯、直觀，可更好的吸引學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣和進(jìn)一步加深同學(xué)們對(duì)相關(guān)專業(yè)知識(shí)的理解，這對(duì)于提高本門課程的教學(xué)效果、加深學(xué)生對(duì)發(fā)酵工業(yè)的理解、培養(yǎng)學(xué)生的科研能力具有非常顯著的促進(jìn)作用。

參考文獻(xiàn)

[1]方海田，張惠玲.實(shí)踐性教學(xué)在生物工程專業(yè)課程教學(xué)改革中的應(yīng)用—《以有機(jī)酸發(fā)酵工藝學(xué)》課程為例[J].內(nèi)蒙古教育，2012，12：44-45.

[2]趙蕾.食品發(fā)酵工藝學(xué)課程的教學(xué)改革與實(shí)踐[J].微生物學(xué)通報(bào)，2009，36（9）：1429-1431.

[3]張秀玲，王鵬，李良.果酒加工工藝學(xué)課程教學(xué)方法及教學(xué)手段的改革研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（社會(huì)科學(xué)版），2008，6（5）：45-46.

[4]Kuforiji O，Kuboye AO，Odunfa SA.Orange and pineapple wastes as potential substrates for citric acid production.International Journal of Plant Biology，2010，1（1）：5-10.

[5]Papagianni M.Advances in citric acid fermentation by Aspergillus niger：Biochemical aspects，membrane transport and modeling[J].Biotechnology Advances，2007，25（3）：244-263.

[6]Crolla A，Kennedy KJ.Fed-batch production of citric acid by Candida lipolytica grown on n-paraffins[J].Journal of Biotech

nology，2004，110（1）：73-84.

[7]Singh Dhillon G，Kaur Brar S，Verma M，et al.Recent advances in citric acid bio-production and recovery[J].Food and Bioprocess Technology，2011，4（4）：505-529.

[8]Sinha J，Tae Bae J，Pil Park J，et al.Effect of substrate concentration on broth rheology and fungal morphology during exo-biopolymer production by Paecilomyces japonica in a batch bioreactor[J].Enzyme and Microbial Technology，2001，29（6-7）：392-399.

[9]Haq IU，Ali S，Qadeer MA，et al. Effect of copper ions on mould morphology and citric acid productivity by Aspergillus niger using molasses based media[J].Process Biochemistry，2002，37（10）：1085-1090.

[10]Krishna C.Solid-State Fermentation Systems–An Overview[J].Critical Reviews in Biotechnology，2005，25（1-2）：1-30.

[11]Rane K D，Sims KA.Oxygen uptake and citric acid production by Candida lipolytica Y 1095[J].Biotechnology and Bioengineering，1994，43（2）：131-137.

[12]Yadav JS.SSF of wheat straw with alcaliphilic Coprinus[J].Biotechnology and Bioengineering，1988，31（5）：414-417.

[13]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T8296-2006檸檬酸. （責(zé)編：徐煥斗）