蛹蟲草菌種提純復壯及其規(guī)律

左雪枝

摘要：以蛹蟲草（Cordycps militaris）子實體為母本，采用組織分離法和子囊單孢子配對法制備子代母種，以母種菌絲形態(tài)、平板培養(yǎng)菌絲生長速度、見光培養(yǎng)菌絲轉色性能、實際栽培出草結果等為菌種性能主要考察指標，探索優(yōu)質菌種提純復壯規(guī)律及方法。結果表明，菌種菌絲濃密、健壯、匍匐狀，生長快、轉色好，則出草形態(tài)好、產量高；組織分離法制備母種試管斜面菌絲形態(tài)優(yōu)良率、平板生長及轉色優(yōu)良率、栽培出草優(yōu)良率可達約95%、90%和85%，分別比子囊單孢子配對法高約10%、25%和40%，后者可產生約20%的更優(yōu)菌株。說明組織分離法更適合遺傳和保持母本性狀，子囊單孢子配對法更適合篩選更優(yōu)菌株，兩種方法均可作為蛹蟲草優(yōu)良菌株提純復壯的方法。

關鍵詞：蛹蟲草（Cordycps militaris）；組織分離法；單孢子配對培養(yǎng)法；產量

中圖分類號：S567.3+9 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）13-3177-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.13.028

Purification-Rejuvenation and Its Law of Cordyceps militaris

ZUO Xue-zhi

（College of Bioengineering， Jingchu University of Technology， Jingmen 448000， Hubei， China）

Abstract：The mother plate culture mycelial morphology， mycelial growth rate， light color， the actual performance of mycelia grown grass results of strain performance of Cordyceps militaris were investigated by the quality of C. militaris as female parent， tissue isolation method and spore culture method paired preparation of sub mother. And the relevant quality spawn rejuvenation rules and method were explored. Results showed that the percentages of fine colonies in tube culture，plate culture， and the percentage of good growth， of spawn prepared by tissue isolation could attain 95%，90%，and 85% respectively， which were separately 10%，25% and 40% higher than those spawn prepared by monospore pairing cultivation， although the latter could produce 20% even better colonies. It was suggested that tissue isolation method was more suitable for the conservation of genetic and maternal character， while spore culture method was a more appropriate choice for screening better strains，although both methods could be used for the rejuvenation of the fine strain of C. militaris.

Key words： Cordyceps militaris； tissue isoloation； spore cultivation； yield

蛹蟲草（Cordycps militaris）又名北冬蟲夏草、北蟲草，為蟲草菌科（Cordycipitaceae）蟲草屬（Cordyceps Link）模式種[1]，20世紀末中國在世界上率先實現其人工栽培，目前規(guī)模化人工栽培及其深加工產業(yè)已初步形成[2，3]。然而，由于蛹蟲草菌種極容易退化，已成為其產業(yè)化發(fā)展的主要瓶頸[3，4]。如何選育和延續(xù)優(yōu)良菌種性能，確立優(yōu)良母種制備及提純復壯方法，對普及和發(fā)展蛹蟲草人工栽培具有重要意義。菌種選育實踐證明，從具有優(yōu)良性狀的真菌子實體中，以組織分離法及經減數分裂所形成的單孢子配對是選育優(yōu)良菌種的基本和有效的方法。為此，從一般蛹蟲草種植者急需對優(yōu)良子實體進行良種選育及保持母本優(yōu)良性狀的實際出發(fā)，比較和探討了子實體組織分離法和子囊單孢子配對法在蛹蟲草良種選育及菌株復壯過程中的規(guī)律、特點及相關技術參數，以供相關人員借鑒。

1 材料與方法

1.1 菌種

優(yōu)質蛹蟲草原始母種D1由荊楚理工學院食用菌實驗室分離、保藏和提供，供試子實體為該母種瓶栽后代。

1.2 培養(yǎng)基

母種分離培養(yǎng)基（改良PDA培養(yǎng)基）：200 g馬鈴薯（去皮），20 g葡萄糖，5 g蛋白胨，1 g磷酸二氫鉀，0.8 g硫酸鎂，15 g瓊脂，去離子水定容至1 000 mL，pH自然（實測值約6.5）；

栽培岀草培養(yǎng)基：30 g大米，45 mL營養(yǎng)液。其中營養(yǎng)液配方：30 g蠶蛹粉，1 g磷酸二氫鉀，0.8 g硫酸鎂，10 mg 維生素B1，去離子水定容至1 000 mL，pH 7.5；

液體菌種培養(yǎng)基：30 g可溶性淀粉，10 g葡萄糖，10 g蛋白胨，2 g磷酸二氫鉀，2 g硫酸鎂，10 mg 維生素B1，去離子水定容至1 000 mL，pH 6.5；

菌絲生長及性能檢測培養(yǎng)基（平板培養(yǎng)基）：200 g馬鈴薯（去皮），20 g葡萄糖，10 g蛋白胨，15 g瓊脂，1 g磷酸二氫鉀，0.8 g硫酸鎂，10 mg 維生素B1，去離子水定容至1 000 mL，pH自然；

1.3 方法

1.3.1 子代母種的制備 選取子實體數目較多、普遍粗且長、顏色典型、生長健壯的蛹蟲草數瓶，從中選擇較優(yōu)子實體作為組織分離及子囊單孢子分離材料。組織分離法：以無菌去離子水清洗子實體3～4次，無菌條件下切取中上部2～3 cm小段，刮去橘紅色外皮，切成1～2 mm小塊，接入改良PDA試管斜面，適宜溫度避光培養(yǎng)[5]（Y1）。單子囊孢子配對法：選取約七分熟子座，無菌去離子水沖洗，無菌濾紙吸干后懸掛于改良PDA錐形瓶平板上部，20 ℃恒溫避光培養(yǎng)；當子囊單孢子彈射并在培養(yǎng)基平面形成數個早期小單孢菌落時[6]，隨機選取2個單孢菌落轉移至新的試管斜面并相互靠近，20 ℃避光培養(yǎng)（Y2）。各試管菌絲長滿斜面即為子代母種。觀察各組母種及各菌株菌絲色澤、形態(tài)、生長趨勢等情況，與優(yōu)質母種相比較，初步判斷母種性能及差異。

1.3.2 母種轉接至平板培養(yǎng)基 將制備的各子代母種取1 mm大小菌塊，分別接種至菌絲生長及性能檢測培養(yǎng)基，先避光培養(yǎng)5 d后再光照培養(yǎng)5 d，觀察各組及各菌株菌絲形態(tài)、生長速度、轉色程度等情況[7]；

1.3.3 母種轉擴為液體菌種 另取制備的各子代母種5 mm大小菌塊，接入150 mL液體培養(yǎng)基中，搖床150 r/min培養(yǎng)5～7 d至液體菌種成熟，比較觀察各組及各菌株菌絲球大小、濃密、菌液狀況[8]；

1.3.4 栽培出草及菌種性能分析 將成熟后的液體菌種，按培養(yǎng)基體積的約10%接種量接入栽培出草培養(yǎng)基（本試驗接入量均為6 mL），置于人工氣候箱中適宜條件下培養(yǎng)[9]，比較觀察各組及各菌株在菌絲萌發(fā)、生長、轉色、出草、子實體形態(tài)、產量等方面表現出的菌種性能及規(guī)律。以出草產量及質量為主要指標，分析探究不同提純復壯方法對菌種性能的影響、趨勢及規(guī)律。試驗以優(yōu)質原始蛹蟲草母種為對照（Y0），5個重復（編號1～5）；各試驗組制備復壯菌種20個菌株（編號1～20）；各菌株栽培出草10瓶重復。

2 結果與分析

2.1 原始母種培養(yǎng)性能及栽培出草

原始母種平板培養(yǎng)、液體培養(yǎng)及栽培出草結果見表1。從表1可以看出，Y0組各菌株于試管斜面避光培養(yǎng)階段均表現為潔白、濃密、健壯，緊貼斜面匍匐狀生長，氣生菌絲少，形態(tài)基本一致。

2.2 組織分離法復壯菌種性能及栽培出草

Y1組各菌株平板及液體培養(yǎng)特征、栽培出草情況見表2。從表2可以看出，各菌株于試管斜面均表現為潔白、匍匐狀，僅20號菌株長勢較差，菌絲較瘦弱、稀少，其余各菌株與優(yōu)良親本母種形態(tài)較為一致。

從表2可以看出，Y1組各菌株平板避光及見光培養(yǎng)表現出一定性狀差異。其中1～18號原潔白、健壯、濃密、匍匐狀菌株，平板培養(yǎng)菌落形態(tài)、生長速度、轉色程度等與Y0組基本一致，出草結果亦與Y0組較為接近；僅19及20號菌株轉為淡黃色，前者出草能力顯著低下、后者不能出草。結合表1，顯然與其轉色性能較差有關。14號菌株生長速度較快，出草量亦較高。從各菌種菌株液體培養(yǎng)情況來看，1～18號菌株菌液細密黏稠，與其菌絲生長較快性能相一致，說明其液體培養(yǎng)生物量較高，因而出草形態(tài)較好、產量亦較高。從該組各菌株整體情況看，試管及平板避光培養(yǎng)，菌絲潔白、健壯、濃密、匍匐狀，則生長速度較快，見光培養(yǎng)轉色性能較好，液體培養(yǎng)菌絲球細密、菌液黏稠，出草性能較好；尤其轉色性能與出草結果有較大的一致性，說明菌絲潔白、健壯、濃密、匍匐狀，液體培養(yǎng)菌絲細密黏稠，尤其轉色性能良好，是優(yōu)良菌種的重要表現。試驗中也觀察到，瘦弱、絨毛狀菌株生長較慢，轉色性能較差，生物量顯著低于其他菌株，栽培出草過程菌絲吃料緩慢、不出草。

2.3 單子囊孢子配對復壯菌種性能及栽培出草

單子囊孢子配對復壯菌種各菌株平板、液體培養(yǎng)及栽培出草情況見表3。從表3可以看出，Y2組各菌株于母種斜面階段即較Y1組菌株性狀分化明顯。其中，1～17號菌株菌絲潔白、健壯、濃密、匍匐狀，18、19號菌株氣生菌絲較明顯、瘦弱，長勢較差；20號菌株氣生菌絲明顯，呈絨毛狀且色較暗。

從表3可以看出，1～16號菌株平板培養(yǎng)仍保持母種匍匐、濃密狀性狀，生長較快，絕大部分菌株轉色性能較好，液體培養(yǎng)菌液細密黏稠，出草量亦較高。進一步說明菌絲潔白、健壯、濃密、匍匐狀生長較快、可良好轉色及菌液黏稠細密，是菌種優(yōu)良性狀表現。其中，7、8、11及6號菌株生長較迅速、轉色明顯較快、較深，菌液亦較黏稠細密，出草量亦明顯超過對照組，可達19～21 g/瓶的較高水平；而9、4號菌株盡管菌絲生長速度高于7、8和11號菌株，但由于不轉色或轉色淡，不出草。16～20號菌株母種斜面或平板培養(yǎng)即已表現出稀疏、瘦弱、氣生菌絲較多、絨毛狀、色暗或生長較緩慢等不良性狀，光照培養(yǎng)轉色淡或不轉色，液體培養(yǎng)大都菌絲球粗大、菌液較清澈，栽培不出草。顯然較Y1具有更強的變異性及兩極分化趨勢，其中部分菌株更優(yōu)，有利于復壯和選育更優(yōu)菌株。

2.4 復壯菌種性能與出草結果分析

出草產量及子實體形態(tài)是菌種性能的根本體現。試驗結果表明，Y1及Y2組各菌株出草產量及子實體形態(tài)表現有明顯差異，產量較高者，草體形態(tài)典型；產量較低者，草體矮小、分叉、叢枝等畸形；以形態(tài)及產量與對照組相當或較接近為優(yōu)良（大于15 g/瓶），草體明顯畸形且產量明顯較低為劣質（低于5 g/瓶），則Y1和Y2組出草結果差別明顯。Y1組出草率高達95%，且優(yōu)質草率達85%，劣質及不出草率10%；而Y2組出草率僅達約60%，但草體大多形態(tài)典型、產量較高。進一步跟蹤各組各菌株試管斜面、平板及轉色培養(yǎng)、實際栽培出草等菌種性能，可以看出，盡管Y1及Y2復壯方式不同，其試管斜面培養(yǎng)、平板生長及轉色、液體培養(yǎng)、栽培出草特征及其優(yōu)良率均呈一定下降趨勢，其中良好轉色一般可獲得較好出草結果。分析其原因，菌種菌株避光培養(yǎng)菌絲潔白、濃密、健壯，緊貼培養(yǎng)基表面匍匐生長，氣生菌絲少，生長迅速，則有利于菌絲體從培養(yǎng)基質內部吸收充足營養(yǎng)；液體培養(yǎng)菌絲球細密、菌液黏稠，則菌絲細胞較多、代謝旺盛而易于積累相關物質，為見光轉色、出草等生殖生長奠定了良好的基礎。良好轉色是生殖生長的重要標志，是出草等生殖生長過程的重要環(huán)節(jié)和基礎[9，10]。菌絲潔白、濃密、健壯、匍匐狀生長快、見光轉色好、轉色快、轉色深，則菌種萌發(fā)快、滿瓶時間短、出草形態(tài)好、產量高；相反菌絲瘦弱、灰暗、氣生菌絲多、轉色淺則不出草或為劣質草，尤其不轉色則不出草，與菌種培養(yǎng)性能基本相吻合。說明菌種固體及液體培養(yǎng)特征是菌種性能的基本體現，其中良好轉色是栽培出草的重要基礎。其中，Y2組中4株菌株其菌種性能及產量明顯高于對照組，可用于選育、提純及復壯更優(yōu)菌株。

3 小結與討論

組織分離法及孢子配對法是絲狀真菌菌種分離及良種選育的主要方法。鎖現民等[5]、楊玉紅等[6]研究結果表明，以蛹蟲草子實體中上部及尖端組織作分離材料，菌種性能較佳，本試驗鑒于蛹蟲草菌絲性能易于退化，以菌絲組織形成較晚的子實體中上部為分離材料，證實以其提純及復壯菌種，出草優(yōu)良率可達85%，說明組織分離法可較好地保持和遺傳母本優(yōu)良性狀，且操作較為簡便，可作為一般蛹蟲草種植戶及優(yōu)質蛹蟲草菌種分離、篩選及提純復壯的方法。同時試驗結果還表明，以單子囊孢子配對方式制備及復壯菌種，盡管不出草比例可高達約40%，但出草菌株大多形態(tài)典型、產量較高，更優(yōu)菌株比例可達約20%，與潘葳[10]、高新華等[11]的研究結果基本一致。梁宗琦[12]、高新華[13]研究證實，蛹蟲草為二極性異宗配合，潘葳[10]、高新華等[11]、梁月等[14]進一步證實少數單子囊孢子在適宜條件下仍可正常出草、存在“假同宗配合”等現象，說明盡管蛹蟲草有性生殖過程復雜，但仍應以單子囊孢子配對作為篩選、復壯和選育更優(yōu)菌株的主要方法。試驗還進一步表明，在菌種分離、復壯及良種選育過程中，可選取菌絲濃密、健壯、匍匐狀，氣生菌絲少，生長迅速，轉色快且深，作為優(yōu)良菌種初步篩選的主要指標，但仍應以栽培出草試驗作為菌種性能鑒定的根本依據。

致謝：本文在荊楚理工學院生物工程學院方華舟老師指導下完成，孫露露、談晶等同學亦做了大量的試驗工作，在此一并表示感謝！

參考文獻：

[1] 戴玉成，李 玉.中國六種重要藥用真菌名稱的說明[J].菌物學報，2011，30（4）：515-518.

[2] 梁宗琦.中國真菌志（第三十二卷·蟲草屬）[M].北京：科學出版社，2007.

[3] 曾宏彬，宋 斌，李泰輝.蛹蟲草研究進展及其產業(yè)化前景[J].食用菌學報，2011，18（2）：70-74.

[4] 鄭壯麗，黃春華，梅彩英，等.蛹蟲草國內外研究的新進展[J].環(huán)境昆蟲學報，2011，33（2）：225-233.

[5] 鎖現民，蔡樹威，張現法.淺談蛹蟲草栽培菌種制作及鑒定[J].食用菌，2009（4）：41-42.

[6] 楊玉紅，劉 芳，康宗利，等.北蟲草菌種人工分離的研究[J].中國食用菌，2012，31（1）：11-12.

[7] 胡事君，張善信，鄭貴朝.蛹蟲草菌種與培養(yǎng)方法相互篩選技術和應用效果[J].中國食用菌，2009，28（1）：18-19.

[8] 耿麗娟，何莉莉，鄂玉洋，等.菌種保藏條件對蛹蟲草菌絲生長及產量的影響[J].沈陽農業(yè)大學學報，2009，40（2）：165-168.

[9] 張勝友.新法栽培蛹蟲草[M].武漢：華中科技大學出版社，2010.

[10] 潘 葳.蛹蟲草（Cordyceps militaris）子實體形成機制的初步研究[D].北京：中國農業(yè)大學，2007.

[11] 高新華，吳 畏，錢國琛，等.北冬蟲夏草（Cordyceps militaris）單孢菌株配對后對子實體形成的影響與無性型產孢結構關系[J].上海農業(yè)學報，2000，16（S1）：1-6.

[12] 梁宗琦.蛹蟲草（Cordyceps militaris）無性型的多型現象[J].菌物系統(tǒng)，1998，17（1）：57-62.

[13] 高新華.蛹蟲草的交配型研究[J].食用菌學報，2008，15（1）：1-5.

[14] 梁 月，張國珍，安沫平，等.蛹蟲草子囊孢子萌發(fā)及其后代群體培養(yǎng)性狀觀察[J].菌物學報，2005，24（4）：525-532.