根結(jié)線蟲侵染對不同抗性番茄品種葉片葉綠素含量及其熒光參數(shù)的影響

李媛媛 王冰林 錢 程 胡玉榮 鄭慧敏

（1山東省高校生物化學(xué)與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濰坊學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，山東濰坊 261061；2濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東濰坊 261071）

根結(jié)線蟲是為害作物生產(chǎn)最嚴(yán)重的病害之一，能夠侵染包括番茄在內(nèi)的2 000多種植物（Vasyukova et al.，2009）。我國設(shè)施番茄栽培因?yàn)檫B作重茬、復(fù)種指數(shù)高等原因，根結(jié)線蟲發(fā)生非常嚴(yán)重甚至成為流行性病害（李君明 等，2003；李紅雙 等，2006）。根結(jié)線蟲侵染首先侵入植物根部伸長區(qū)，然后逐漸遷移至根部維管束，建立取食地點(diǎn)，破壞維管組織，從而影響植物根系對水分和營養(yǎng)的吸收（Abad et al.，2003）。Dorhout 等（1991）報(bào)道，根結(jié)線蟲侵染導(dǎo)致番茄植株對水分的吸收減少，地上部出現(xiàn)生長遲緩、萎蔫及黃化現(xiàn)象。根結(jié)線蟲侵染也會(huì)顯著影響植物的保護(hù)酶活性、葉片水勢、光合作用、呼吸作用、物質(zhì)代謝等過程（Poskuta et al.，1986；Rahi et al.，1988；Ramakrishnan & Rajendran，1998；郭衍銀 等，2005；李媛媛 等，2011；梁朋 等，2012；Strajnar et al.，2012；王冰林 等，2013）。雖然有關(guān)根結(jié)線蟲侵染對植株生理生化特征的影響研究較多，但是根結(jié)線蟲侵染后，番茄葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化卻鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)以兩個(gè)不同根結(jié)線蟲抗性的番茄品種為試材，通過根結(jié)線蟲侵染過程中葉片葉綠素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化，分析線蟲侵染與葉片生理指標(biāo)變化的關(guān)聯(lián)性，為篩選抗根結(jié)線蟲番茄品種提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試番茄（Solanum lycopersicumL.）品種為世佳101和精選紅桃，由濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。經(jīng)分子標(biāo)記檢測（Williamson et al.，1994），兩個(gè)品種均不含Mi-1基因。供試南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）采自濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地，經(jīng)鑒定后，利用活體番茄苗保種、擴(kuò)繁。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 世佳101和精選紅桃根結(jié)線蟲抗性鑒定 試驗(yàn)于2011年1～6月在濰坊學(xué)院試驗(yàn)基地日光溫室中進(jìn)行。用2%的NaClO溶液浸種30 min，對供試番茄種子進(jìn)行消毒，用無菌水沖冼3次后，置于培養(yǎng)皿中30 ℃催芽。催芽后將其播種至內(nèi)含蔬菜育苗專用基質(zhì)的72孔育苗穴盤中進(jìn)行正常培養(yǎng)。待幼苗長至三葉一心時(shí)移植于直徑8 cm、高17 cm的塑料杯中，每杯1株，杯內(nèi)栽培基質(zhì)（砂∶土=1V∶ 2V）經(jīng)過高溫滅菌處理。

番茄苗長至四葉期后，選擇長勢相同且生長優(yōu)良的植株，在根周圍用打孔器打孔（每杯打5孔），注入根結(jié)線蟲二齡幼蟲（2 000條·杯-1），然后用土掩埋（李媛媛 等，2011）。兩個(gè)品種各接種15株，以注入清水為對照，3次重復(fù)。培養(yǎng)40 d后，參照Garabedian和 van Grundy（1983）的分級標(biāo)準(zhǔn)，調(diào)查每株番茄苗的根結(jié)等級，計(jì)算病情指數(shù)，鑒定抗性等級（白春明 等，2010）。

1.2.2 葉綠素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定 試驗(yàn)于2012年1～6月在濰坊學(xué)院試驗(yàn)基地日光溫室中進(jìn)行。番茄苗培養(yǎng)和線蟲接種均同1.2.1。兩個(gè)品種各接種15株，以注入清水為對照，3次重復(fù)。分別在接種后 0、5、10、15、20 d和 25 d，利用PAM-2100型脈沖調(diào)制式葉綠素?zé)晒鈨x測定番茄功能葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)，包括最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、光合電子傳遞效率（ΦPSⅡ）和非光化學(xué)猝滅系數(shù)（NPQ）。測定結(jié)束后，選取相應(yīng)節(jié)位的葉片保存于超低溫冰箱中，用于測定葉綠素含量。用80%丙酮將葉片研磨、萃取、過濾定容后，以80%丙酮為對照，在紫外-可見分光光度計(jì)上分別測定OD663和OD645。葉綠素a （Chla） 和葉綠素b （Chlb）含量計(jì)算公式參考張志良等（2010），并分別計(jì)算Chl（a+b）含量和Chla/b值。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)處理和圖形繪制采用Microsoft Excel 2003 軟件，方差分析采用 SPSS 11.5軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄品種抗性鑒定

苗期接種鑒定結(jié)果表明：兩個(gè)番茄品種存在明顯抗性差異，世佳101根結(jié)等級為5.0，病情指數(shù)達(dá)到100，屬于高感根結(jié)線蟲品種；精選紅桃根結(jié)等級為2.6，病情指數(shù)為40，屬于中抗根結(jié)線蟲 品種。

表1 根結(jié)線蟲侵染對番茄葉片葉綠素含量的影響

2.2 南方根結(jié)線蟲侵染對番茄葉片葉綠素含量的影響

如表1所示，在未接種的材料中，精選紅桃的Chla含量比世佳101高15.7%，二者差異顯著；接種根結(jié)線蟲15 d后，與清水對照相比，兩個(gè)品種的Chla含量均顯著下降，但精選紅桃下降幅度低于世佳101。兩個(gè)番茄品種的Chlb含量在未接種的材料中差異顯著。接種根結(jié)線蟲后，精選紅桃植株Chlb含量變化較小，差異均未達(dá)到顯著水平；世佳101接種植株Chlb含量在接種20 d后開始顯著降低，到接種25 d時(shí)，比清水對照降低26.9%。在未接種的材料中，兩個(gè)番茄品種的Chl（a+b）含量不存在顯著差異。在接種根結(jié)線蟲20 d后，精選紅桃植株葉片Chl（a+b）含量開始顯著下降，而世佳101植株葉片在接種15 d后即開始顯著下降。未接種材料的Chla/b值一直比較穩(wěn)定，抗病材料精選紅桃葉片Chla/b值是感病材料世佳101的1.43倍。線蟲侵染后，兩個(gè)番茄品種的Chla/b值呈現(xiàn)出不同程度的降低。以上結(jié)果表明，線蟲侵染會(huì)導(dǎo)致番茄葉片葉綠素降解，但是抗性品種的葉綠素降解幅度顯著低于高感品種，即抗性品種在線蟲侵染后其葉綠素含量仍能穩(wěn)定在較高水平，以盡可能維持正常的光合性能。

2.3 南方根結(jié)線蟲侵染對番茄葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm反映了PSⅡ的最大光化學(xué)效率，是光抑制程度的一個(gè)重要指標(biāo)。利用葉綠素?zé)晒鈨x測得根結(jié)線蟲侵染后番茄葉片F(xiàn)v/Fm的變化趨勢如表2。清水對照的兩個(gè)番茄品種的 Fv/Fm一直恒定在0.81左右。線蟲侵染前期，該參數(shù)變化較小，在接種20 d后，世佳101與清水對照相比顯著下降；精選紅桃則在接種后25 d才開始顯著下降。以上結(jié)果表明，在接種后期兩個(gè)品種均發(fā)生光抑制，且世佳101的光抑制強(qiáng)度更高。

葉綠素?zé)晒鈪?shù)ΦPSⅡ表示實(shí)際光化學(xué)效率，其值升高或降低反映植物光合碳同化的促進(jìn)或抑制程度。在清水對照中，兩個(gè)番茄品種的ΦPSⅡ在整個(gè)試驗(yàn)時(shí)期內(nèi)不存在顯著差異（表2）。在接種根結(jié)線蟲前期，兩個(gè)品種的ΦPSⅡ變化幅度較小。接種后15 d，ΦPSⅡ均開始顯著下降，且世佳101下降幅度大于精選紅桃；ΦPSⅡ到接種后25 d達(dá)到最低值，世佳101和精選紅桃分別比清水對照下降26.0%和10.2%。結(jié)果表明，番茄葉片光合碳同化過程由于線蟲的侵染出現(xiàn)了不同程度的抑制，并且世佳101的抑制程度大于精選紅桃。

葉綠素?zé)晒鈪?shù)NPQ值的升高可以保護(hù)光合系統(tǒng)免受損害，以盡可能維持植物的光合性能。根結(jié)線蟲侵染后，兩個(gè)品種葉片的NPQ先呈現(xiàn)上升趨勢，且精選紅桃上升幅度大于世佳101，侵染10 d時(shí)兩個(gè)番茄品種的NPQ出現(xiàn)顯著差異；在接種25 d后NPQ突然顯著下降，但精選紅桃的接種植株葉片NPQ仍顯著高于清水對照（表2）。

表2 根結(jié)線蟲侵染對番茄葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

3 結(jié)論與討論

根結(jié)線蟲侵染番茄植株后，抗病品種和感病品種的葉綠素含量總體呈逐漸下降趨勢，且抗病品種的降低幅度明顯低于高感品種。同時(shí)，線蟲侵染對番茄葉片葉綠素?zé)晒馓匦栽斐擅黠@影響。其中 Fv/Fm和ΦPSⅡ隨著根結(jié)線蟲侵染時(shí)間的延長呈現(xiàn)下降趨勢，高感品種出現(xiàn)顯著降低的時(shí)間要早于抗病品種，降低幅度也大于抗病品種。葉綠素?zé)晒鈪?shù)NPQ隨根結(jié)線蟲侵染呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，抗病品種的上升程度大于感病品種，在接種10 d后，抗感品種的NPQ值出現(xiàn)顯著差異。上述研究結(jié)果表明，線蟲侵染后，中抗品種精選紅桃能夠保持較高的葉綠素含量，光抑制和碳同化過程受影響較小，且熱耗散能力較強(qiáng)，從而使精選紅桃植株生長受線蟲侵染影響較小。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，根結(jié)線蟲侵染導(dǎo)致兩個(gè)番茄品種的葉綠素含量下降，與前人的研究結(jié)果基本一致（Wang et al.，2004；Bilgin et al.，2010；葉德友 等，2011；Korayem et al.，2012）。高感根結(jié)線蟲品種世佳101葉綠素含量降低幅度明顯高于中抗品種精選紅桃，也與前人的研究一致。葉德友等（2011）發(fā)現(xiàn)線蟲侵染后抗病材料葉綠素含量的降低幅度顯著小于感病材料。Chaerle等（2007）認(rèn)為通過監(jiān)控被病菌侵染后植物葉片葉綠素含量的降低程度可以反映植物對病原菌的抗性程度，從而實(shí)現(xiàn)對抗、感植株的篩選。

測定葉片葉綠素含量會(huì)對植株造成一定損傷，且程序繁瑣，應(yīng)用葉綠素?zé)晒鈨x測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化，可以實(shí)現(xiàn)對植株葉片光合性能的無損檢測。本試驗(yàn)測定了根結(jié)線蟲侵染過程中不同抗性番茄品種的葉綠素?zé)晒鈪?shù)的動(dòng)態(tài)變化。其中，F(xiàn)v/Fm表現(xiàn)最穩(wěn)定，在接種早期基本恒定在0.81左右，直到接種20 d后高感品種才出現(xiàn)顯著下降。Rahi等（1988）研究表明，線蟲侵染會(huì)損傷植物根系，影響植株水分吸收，形成葉片生理性缺水，致使葉片氣孔部分關(guān)閉。Baker和Rosenqvist（2004）認(rèn)為水分脅迫早期葉片氣孔的部分關(guān)閉會(huì)導(dǎo)致CO2的吸收量減少，影響光合作用的暗反應(yīng)，但不會(huì)影響PSⅡ，因此Fv/Fm變化不大；水分脅迫后期，水分的進(jìn)一步匱缺會(huì)導(dǎo)致Fv/Fm出現(xiàn)下降趨勢（Jansen et al.，2009；Mishra et al.，2012）。ΦPSⅡ和NPQ在接種初期基本保持穩(wěn)定，可能意味著葉片吸收的光能能夠被暗反應(yīng)和光呼吸作用完全利用（M ü ller et al.，2001；Ort & Baker，2002）。Omasa和Takayama（2003）研究報(bào)道，無論氣孔關(guān)閉與否，NPQ和ΦPSⅡ都不會(huì)發(fā)生改變，但如果在強(qiáng)光照射下NPQ和ΦPSⅡ會(huì)出現(xiàn)明顯的上升和下降趨勢。本試驗(yàn)中，與清水對照相比，番茄植株葉片自接種后15 d開始，ΦPSⅡ出現(xiàn)了顯著下降；NPQ則分別在接種10 d（精選紅桃）和15 d（世佳101）后出現(xiàn)了顯著上升，可能表明葉片吸收的光能不能夠被CO2固定和光呼吸途徑充分利用，非光化學(xué)機(jī)制被快速啟動(dòng)。NPQ值的升高可以保護(hù)光合系統(tǒng)免受損害，以盡可能維持植物的光合 性能。

大量研究表明，葉綠素?zé)晒鈪?shù)能夠穩(wěn)定遺傳， 并 且 前 人 已 在 小 麥（Czyczy?o-Mysza et al.，2013）、玉米（?imi? et al.，2014）等作物中對葉綠素?zé)晒鈪?shù)進(jìn)行了QTL定位，開展了相關(guān)分子基礎(chǔ)等方面的研究。綜合本試驗(yàn)結(jié)果，通過檢測葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm、ΦPSⅡ和NPQ的變化，可以無損、便捷地提供番茄抗感根結(jié)線蟲的相關(guān)信息，并且由于NPQ在接種材料中出現(xiàn)差異的時(shí)間最早，因此NPQ可能是一個(gè)更適合于在田間無損檢測番茄抗感根結(jié)線蟲材料的葉綠素?zé)晒鈪?shù)。但葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定受諸多因素影響，因此關(guān)于NPQ的田間適用性還有待于進(jìn)一步試驗(yàn)研究。

白春明，段玉璽，陳立杰，劉軼飛，朱曉峰．2010．番茄品種對南方根結(jié)線蟲的抗性評價(jià)．中國蔬菜，（6）：33-37．

郭衍銀，王秀峰，徐坤，張廣民．2005．生姜對南方根結(jié)線蟲侵染的生理生化反應(yīng)．植物病理學(xué)報(bào)，35（1）：49-54．

李紅雙，李景富，許向陽．2006．番茄抗根結(jié)線蟲病基因的RAPD和SCAR標(biāo)記．植物病理學(xué)報(bào)，36（2）：185-188．

李君明，宋燕，徐和金，周永健，Carole Carabta，馮蘭香．2003．利用PCR技術(shù)同時(shí)鑒定番茄抗根結(jié)線蟲和抗斑萎病毒基因．園藝學(xué)報(bào)，30（6）：678-682．

李媛媛，魯麗鑫，王冰林．2011．根結(jié)線蟲侵染對番茄葉片保護(hù)酶活性及膜脂過氧化的影響．濰坊學(xué)院學(xué)報(bào)，11（6）：73-76．

梁朋，陳振德，羅慶熙．2012．南方根結(jié)線蟲對不同砧木嫁接番茄苗活性氧清除系統(tǒng)的影響．生態(tài)學(xué)報(bào)，32（7）：2294-2302．

王冰林，徐廣賓，李媛媛．2013．根結(jié)線蟲侵染對茄子葉片葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊懀袊r(nóng)學(xué)通報(bào)，29（1）：94-97．

葉德友，錢春桃，陳勁楓．2011．酸黃瓜對南方根結(jié)線蟲抗性的光合響應(yīng)．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，44（20）：4248-4257．

張志良，瞿偉菁，李小芳．2010．植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)（第四 版）．北京：高等教育出版社：58-61．

Abad P，F(xiàn)avery B，Rosso M N，Castagnone-Sereno P．2003．Root-knot nematode parasitism and host response：molecular basis of a sophisticated interaction．Molecular Plant Pathology，4：217-224.

Baker N R，Rosenqvist E．2004．Applications of chlorophyll fluorescence can improve crop production strategies：an examination of future possibilities．Journal of Experimental Botany，55：1607-1621．

Bilgin D D，Zavala J A，Zhu J，Clough S J，Ort D R，DeLucia E H．2010．Biotic stress globally downregulates photosynthesis genes．Plant，Cell and Environment，33：1597-1613．

Chaerle L，Leinonen I，Jones H G，van der Straeten D．2007．Monitoring and screening plant populations with combined thermal and chlorophyll fluorescence imaging．Journal of Experimental Botany，58：773-784．

Czyczy?o-Mysza I，Tyrka M，Marc iń ska I，Skrzypek E，Karbarz M，Dziurka M，Hura T，Dziurka K，Quarrie S A．2013．Quantitative trait loci for leaf chlorophyll fluorescence parameters，chlorophyll and carotenoid contents in relation to biomass and yield in bread wheat and their chromosome deletion bin assignments．Molecular Breeding，32：189-210．

Dorhout R，Gommers F J，Koll?ffel C．1991．Water transport through tomato roots infected withMeloidogyne incognita．Phytopathology，81：379-385．

Garabedian S，van Grundy S D．1983．Use of avermectins for the control ofMeloidogyne incognitaon tomatoes．Journal of Nematology，15：503-510．

Jansen M，Gilmer F，Biskup B，Nagel K A，Rascher U，F(xiàn)ischbach A，Briem S，Dreissen G，Tittmann S，Braun S，De Jaeger I，Metzlaff M，Schurr U，Walter A．2009．Simultaneous phenotyping of leaf growth and chlorophyll fluorescence via GROWSCREEN FLUORO allows detection of stress tolerance inArabidopsis thalianaand other rosette plants．Functional Plant Biology，36：902-914．

Korayem A M，El-Bassiouny H M S，EI-Monem A A A，Mohamed M M M．2012．Physiological and biochemical changes in different sugar beet genotypes infected with root-knot nematode．Acta Physiologiae Plantarum，34：1847-1861．

Mishra K B，Iannacone R，Petrozza A，Mishra A，Armentano N，La Vecchia G，T rtí lek M，Cellini F，Nedbal L ．2012．Engineered drought tolerance in tomato plants is reflected in chlorophyll fluorescence emission．Plant Science，182：79-86．

M ü ller P，Li X P，Niyogi K K．2001．Non-photochemical quenching．A response to excess light energy．Plant Physiology，125：1558-1566．

Omasa K，Takayama K．2003．Simultaneous measurement of stomatal conductance，non-photochemical quenching，and photochemical yield of photosystem II in intact leaves by thermal and chlorophyll fluorescence imaging．Plant and Cell Physiology，44：1290-1300．Ort D R，Baker N R ．2002．A photoprotective role for O2as an alternative electron sink in photosynthesis? Current Opinion in Plant Biology，5：193-198．

Poskuta J W，Dropkin V H，Nelson C J．1986．Photosynthesis，photorespiration and respiration of soybean after infection with root nematodes．Photosynthetica，20：405-410．

Rahi G S，Rich J R，Hodge C．1988．Effect ofMeloidogyne incognitaandM．javanicaon leaf water potential and water use of tobacco．Journal of Nematology，20：516-522．

Ramakrishnan S，Rajendran G．1998．Influence ofMeloidogyne incognitaonon yield components and physiological functions of papaya．Nematologia Mediterranea，26：225-228．

?imi? D，Lepedu? H，Jurkovi? V，Antunovi? J，Cesar V．2014．Quantitative genetic analysis of chlorophyll a fluorescence parameters in maize in the field environments．Journal of Integrative Plant Biogoly，56：695-708．

Strajnar P，?irca S，Urek G，?ircelj H，?eleznik P，Vodnik D． 2012．Effect ofMeloidogyne ethiopicaparasitism on water management and physiological stress in tomato．European Journal of Plant Pathology，132：49-57．

Vasyukova N I，Zinovieva S V，Udalova Z V，Gerasimova N G，Ozeretskovskaya O L，Sonin M D．2009．Jasmonic acid and tomato resistance to the root-knot nematodeMeloidogyne incognita． Doklady Biological Sciences，428：448-450．

Wang T，Quisenberry S S，Ni X，Tolmay V．2004．Enzymatic chlorophyll degradation in wheat near-isogenic lines elicited by cereal aphid（Homoptera：Aphididae）feeding．Journal of Economic Entomology，97：661-667．

Williamson V M，Ho J Y，Wu F F，Miller N，Kaloshian I．1994．A PCR-based marker tightly linked to the nematode resistance gene，Mi，in tomato．Theoretical and Applied Genetics，87：757-763．