馬鈴薯卷葉病毒CP基因水溶性原核表達的研究

牛倩雅 辛 佳 王晶珊 楊 煜 李廣存 郭寶太*

（1青島農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，山東青島 266109；2山東省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，山東濟南 250100）

馬鈴薯卷葉病毒（Potato leafroll virus，PLRV）是黃癥病毒科（Luteoviridae）成員，可引起馬鈴薯葉片縱向卷曲等癥狀，導致減產(chǎn)，引起品種退化，危害非常嚴重。馬鈴薯病毒粒體提取、純化困難，PLRV的分布局限于寄主植株的維管束內(nèi)，含量低，提取純化尤其困難。我國自主研制的PLRV抗血清缺乏，遠遠不能滿足其研究與脫毒種苗生產(chǎn)中對PLRV進行ELISA檢測的需求。

PLRV-CP基因長度為627 bp，在我國6種馬鈴薯主要病毒中，其CP基因是最小的，但該基因密碼子組成特別，原核表達非常困難，是利用原核表達重組CP制備PLRV特異性抗血清的障礙。PLRV-CP基因原核表達的困難可通過不同的技術(shù) 途 徑 克 服（Lopez et al．，1994；Pichova et al．，2011）。青島農(nóng)業(yè)大學遺傳研究室通過刪除抑制翻譯的126 bp片段，實現(xiàn)了其突變基因的高效原核表達，并利用重組CP制備出了PLRV抗血清（隋炯明 等，2012），且獲得的抗體與酶標抗體可用于PLRV的DAS-ELISA檢測（李楠楠 等，2011），為大量組裝PLRV的ELISA試劑盒奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

與病毒粒體作抗原相比，重組CP途徑具有抗原制備效率高、純度高，沒有病毒擴散的潛在危害等優(yōu)點。目前大多采用變性的重組蛋白作抗原制備馬鈴薯病毒抗血清，變性蛋白不具有天然的構(gòu)象，與病毒粒體的抗原決定簇會存在差異。本試驗目的是建立PLRV-CP基因水溶性原核表達體系，為利用水溶性重組CP制備出檢測能力更強的PLRV抗血清奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 載體與菌株

分子伴侶原核表達質(zhì)粒、冷激誘導原核表達載體pColdⅠ與pMD18-T克隆載體購自寶生物工程（大連）有限公司。PLRV-CP突變基因的原核表達載體pBAD-LRCP-126由本實驗室構(gòu)建（隋炯明 等，2012），簡寫為pBAD-LRCP，該基因受PBAD啟動子驅(qū)動表達。大腸桿菌菌株DH5α、BL21（DE3）、TOP10由本實驗室保存。

1.2 試劑與試劑盒

DNA marker、限制性內(nèi)切酶、TaqDNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶等購自寶生物工程（大連）有限公司，質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。溶菌酶、蛋白酶抑制劑PMSF購自Sigma公司。

1.3 PCR引物

PLRV-CP基因的擴增引物P1的序列為：5′-CATATGAGTACGGTCGTGG -3′（含NdeⅠ酶切位點）；P2：5′-AAGCTTTTTGGGGTTTTGCAA-3′（含Hind Ⅲ酶切位點），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 利用分子伴侶增強PLRV-CP基因的水溶性表達

分別用5種可表達出分子伴侶的質(zhì)粒（表1）轉(zhuǎn)化重組菌TOP10（pBAD-LRCP），獲得既含pBAD-LRCP又含分子伴侶原核表達載體的轉(zhuǎn)化子。

將5種轉(zhuǎn)化子分別在37 ℃，Amp終濃度100 μg·mL-1，Cm終濃度50 μg·mL-1的液體LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，在OD600值達到0.6～0.9時，加入合適的誘導物使PLRV-CP基因與分子伴侶基因同時表達。

表1 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒及其表達的分子伴侶

1.5 利用冷激蛋白啟動子增強PLRV-CP基因的水溶性表達

以pBAD-LRCP為模版，用引物P1、P2進行PCR擴增，電泳后回收含PLRV-CP基因的條帶并與pMD18-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α，經(jīng)酶切鑒定與測序篩選出目的克隆，其重組質(zhì)粒命名為pMD18-LRCP。

pColdⅠDNA經(jīng)NdeⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后回收大小約為4 000 bp的大片段，pMD18-LRCP質(zhì)粒經(jīng)同樣的雙酶切后回收500 bp的小片段，兩個片段的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細胞，通過酶切鑒定與測序確認表達載體的正確性，并命名為pCold-LRCP。

將重組菌BL21（pCold-LRCP）接種于液體LB培養(yǎng)基（Amp 濃度 100 μg·mL-1）中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，按1∶100將過夜培養(yǎng)物接種于新鮮的LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)約3 h，OD600的值達到0.4～0.5，吸出1 mL菌液作為未誘導的對照，剩余菌液中加入IPTG至終濃度為0.1 mmol·L-1，15 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，誘導目的蛋白的表達。

1.6 測序

PLRV-CP基因亞克隆及原核表達載體構(gòu)建中，測序分別采用針對pMD18-T與pColdⅠ的載體引物進行，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.7 菌體蛋白的提取與SDS-PAGE分析

菌體蛋白的提取采用溶菌酶法，取40 μL提取的上清蛋白加入10 μL 5×上樣緩沖液混勻；未經(jīng)誘導的菌體及提取的包涵體用1×蛋白上樣緩沖液懸??；上述樣品煮沸離心后，各取20 μL上清點樣，用12%的SDS-PAGE分析水溶性表達效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子伴侶與PLRV-CP基因的水溶性表達

限制性酶切結(jié)果顯示，質(zhì)粒pG-KJE8中無NdeⅠ的切點（圖1，泳道1～3），pBAD-LRCP中有預期NdeⅠ的單切點（圖1，泳道6～7），pGKJE8轉(zhuǎn)化TOP10（pBAD-LRCP）獲得的單菌落中既有質(zhì)粒pBAD-LRCP，也有pG-KJE8（圖1，泳道4～5），是符合要求的轉(zhuǎn)化子，命名為LR-1。用另外4種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，均獲得了抗Amp與Cm的轉(zhuǎn)化子（LR-2～LR-5）。

圖1 轉(zhuǎn)化子LR-1的酶切鑒定

前期的研究表明，表達載體pBAD-LRCP中，PLRV-CP基因5′端有鐵氧還蛋白基因的片段，采用了融合表達的策略，但表達出的水溶性重組蛋白極少。本試驗用轉(zhuǎn)化子LR-1提取總蛋白，SDSPAGE分析顯示，上清中有一條34 kD的特異性水溶性蛋白質(zhì)條帶（圖2，泳道2），但重組蛋白主要以包涵體形式存在（圖2，泳道3）。轉(zhuǎn)化子LR-2誘導出的水溶性目的蛋白條帶很明顯（圖3，泳道3），其水溶性的表達水平與LR-1相當，另外3種轉(zhuǎn)化子中水溶性重組蛋白的表達量低于LR-1與LR-2。表明分子伴侶的存在使水相中的PLRV重組CP蛋白的量有明顯提高，但沒有期望的多。

圖2 轉(zhuǎn)化子LR-1中PLRV-CP基因的表達

圖3 轉(zhuǎn)化子LR-2中PLRV-CP基因的表達

2.2 冷激蛋白啟動子與 PLRV-CP基因的水溶性表達

對PLRV-CP基因進行了T-A亞克隆，測序結(jié)果表明5′與3′分別含NdeⅠ切點、Hind Ⅲ切點的PLRV-CP基因序列已插入T載體中，該重組質(zhì)粒命名為pMD18-LRCP。

pMD18-LRCP與pColdⅠ經(jīng)NdeⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后，回收相應的片段連接，酶切結(jié)果表明，PLRV-CP基因序列已插入表達載體中（圖4），測序結(jié)果顯示PLRV-CP基因的冷激誘導原核表達載體構(gòu)建正確，命名為pCold-LRCP。圖5是該表達載體pCold-LRCP的圖譜，PLRV-CP基因長度為498 bp，處于cspA基因啟動子下游，其表達產(chǎn)物的分子量約為20 kD。

重組菌BL21（pCold-LRCP）經(jīng)低溫誘導，SDS-PAGE檢測表明在20 kD處有一條明顯的特異性蛋白條帶（圖6，泳道2～4），其分子量符合預期，水溶性蛋白中該條帶清晰（圖6，泳道2～3）。表明冷激蛋白啟動子可以增強PLRV-CP基因的水溶原核表達量，且效果好于分子伴侶。

圖4 重組質(zhì)粒pCold-LRCP的酶切圖譜

圖5 pCold-LRCP質(zhì)粒圖譜

圖6 PLRV-CP基因的冷激誘導表達

3 結(jié)論與討論

本試驗比較了提高PLRV-CP基因水溶性表達效果的兩種途徑。首先，用5種表達分子伴侶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化重組菌TOP10（pBAD-LRCP），均可獲得PLRV-CP基因水溶性表達水平提高的轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子LR-1與LR-2中PLRV重組CP的水溶性表達量較高，另外3種轉(zhuǎn)化子的表達量低。其次，利用pColdⅠ構(gòu)建出了PLRV-CP基因的原核表達載體，在冷激蛋白基因cspA的啟動驅(qū)動下，該基因的水溶性表達水平明顯提高，且水溶性重組CP表達量高于分子伴侶途徑。第二種途徑更適合于PLRV水溶性重組CP及其抗血清的大量制備。

大腸桿菌分子伴侶具有協(xié)助蛋白質(zhì)正確折疊，形成天然構(gòu)象的作用，它可增進原核表達重組蛋白的水溶性（崔碩碩 等，2011；許鵬 等，2012）。本試驗中轉(zhuǎn)化子LR-1表達出的伴侶蛋白是DnaKDnaJ-GrpE和GroES-GroEL兩組分子伴侶蛋白，LR-2表達出的伴侶蛋白是GroES-GroEL，但兩種轉(zhuǎn)化子的水溶性重組蛋白表達量接近。即使在分子伴侶存在的情況下，PLRV重組CP仍然以包涵體形式為主，水溶性表達量較低。亓振國等（2011）研究發(fā)現(xiàn)原核表達中，GroES與GroEL具有抑制玉米西羅葉綠三酸:鐵螯合酶在菌體內(nèi)聚集的作用，但DnaK及DnaJ沒有這種作用。針對一個具體的基因，分子伴侶對其水溶性原核表達的作用很難預測，需要通過試驗確認。

冷激蛋白啟動子可實現(xiàn)低溫條件下目的基因的原核表達，也具有增強重組蛋白水溶性表達量的作用（屠小菊 等，2010；杜慶輝 等，2012）。本試驗表明在冷激誘導啟動子驅(qū)動下，水溶性PLRV重組CP的帶型清晰，在總蛋白中占的比例也明顯高于分子伴侶途徑。擴大菌液培養(yǎng)與誘導體系，并將提取的上清蛋白液濃縮后，可通過鎳離子親和層析純化出足量PLRV水溶性CP，滿足制備PLRV抗血清之需。同時有必要進一步優(yōu)化表達體系，提高其表達量，從而提高純化效率與純化量。

Raikhy等（2007）利用水溶性重組CP蛋白制備出了香石竹蝕環(huán)病毒（CERV）抗血清，表明純化抗體（IgG）及其酶標抗體可用于CERV的DASELISA檢測，效果達到了商品試劑盒的檢測水平。馬鈴薯重組CP抗血清的報道中，均采用了純化后的變性蛋白作抗原，未見利用水溶性重組蛋白作抗原的研究；用水溶性重組CP作抗原具有制備出高質(zhì)量馬鈴薯病毒抗血清的潛力，是一個值得深入研究的新領(lǐng)域。

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