環(huán)氧化酶1、P2Y1、GPⅠa及GPⅢa基因多態(tài)性與阿司匹林抵抗的相關(guān)性研究

王 林,黃永高,張意仲,湯永華,趙小飛

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·短篇論著·

環(huán)氧化酶1、P2Y1、GPⅠa及GPⅢa基因多態(tài)性與阿司匹林抵抗的相關(guān)性研究

王 林,黃永高,張意仲,湯永華,趙小飛

目的 探討環(huán)氧化酶1(COX-1)(A842G、C50T)、P2Y1(A1622G、C893T)、GPⅠa(C807T、 G873A)及GPⅢa(T1565C)4個基因中7個位點(diǎn)的多態(tài)性與阿司匹林(ASP)抵抗(AR)的相關(guān)性。方法 選取2011年10月—2013年12月武警浙江省總隊(duì)杭州醫(yī)院內(nèi)科住院的動脈粥樣硬化患者243例，測定患者血小板聚集(PA)率，并將患者分為AR組，ASP半抵抗(ASR)組，ASP敏感(AS)組。測定各組COX-1、P2Y1、GPⅠa及GPⅢa基因型。比較3組患者一般資料及COX-1、P2Y1、GPⅠa、GPⅢa基因多態(tài)性。結(jié)果 AR組28例，ASR組71例，AS組144例。3組患者的年齡、性別、吸煙率、高血壓發(fā)生率、總膽固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3組患者糖尿病發(fā)生率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；AS組患者糖尿病發(fā)生率低于AR組(P<0.05)。3組間COX-1(842 A>G)、COX-1(50 C>T)、P2Y1(1622 A>G)、GPⅠa(873 G>A)、GPⅢa(1565 T>C)頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3組間P2Y1(893 C>T)和GPⅠa(807 C>T)頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AR組和ASR組P2Y1(893 C>T)、GPⅠa(807 C>T)頻率高于AS組(P<0.01)。結(jié)論 P2Y1 (C893T)、GPⅠa (C807T)等位基因的變異與AR具有一定程度的關(guān)聯(lián)，為指導(dǎo)臨床用藥提供了參考依據(jù)。

多態(tài)性,單核苷酸；阿司匹林抵抗；血小板聚集

王林,黃永高,張意仲,等.環(huán)氧化酶1、P2Y1、GPⅠa及GPⅢa基因多態(tài)性與阿司匹林抵抗的相關(guān)性研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2015，18(15)：1832-1835.[www.chinagp.net]

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表1 基因擴(kuò)增引物及長度

藥物遺傳學(xué)主要是研究不同個體遺傳因素對于藥物代謝和藥物反應(yīng)的影響，藥物遺傳多態(tài)性表現(xiàn)為藥物代謝酶、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及藥物作用靶點(diǎn)的多態(tài)性。目前，中國人群中慢性疾病遺傳機(jī)制和藥物治療的有效性及安全性研究已經(jīng)成為我國醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重點(diǎn)課題之一。心血管疾病已經(jīng)成為影響人類健康的最大殺手，阿司匹林(aspirin，ASP)則是治療缺血性心腦血管疾病的基石，基因變異可能是患者對ASP敏感性下降的重要原因[1-3]。本研究選取4個基因的7個多態(tài)性位點(diǎn)環(huán)氧化酶1(COX-1)(A842G、C50T)、P2Y1(A1622G、C893T)、GPⅠa(C807T、G873A)、GPⅢa(T1565C)，以探討基因多態(tài)性與ASP抵抗(aspirin resistance，AR)的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2011年10月—2013年12月武警浙江省總隊(duì)杭州醫(yī)院內(nèi)科住院的動脈粥樣硬化患者243例，均服用ASP 100 mg/d，服藥時(shí)間>14 d。其中男184例，女59例；年齡48～92歲，平均(69.8±14.3)歲；合并高血壓136例、糖尿病69例、冠心病33例；既往腦梗死病史87例、高脂血癥病史66例。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患有急慢性血液系統(tǒng)疾病者；(2)入選前3周內(nèi)應(yīng)用ASP劑量≥100 mg/d，或服用除ASP外其他抗血小板或?qū)ρ“骞δ苡杏绊懙乃幬镎撸?3)有嚴(yán)重肝、腎功能損害者。本研究經(jīng)過本院倫理委員會批準(zhǔn)并在患者簽字同意的情況下進(jìn)行。

1.2 研究方法

1.2.1 測定血小板聚集(PA)率 清晨采集空腹前臂靜脈血5 ml,將枸櫞酸鈉抗凝標(biāo)本在室溫下200×g離心10 min，制備富含血小板血漿(PRP),移去PRP加蓋靜置，剩余標(biāo)本在室溫下1 600×g離心10 min，制備貧血小板血漿(PPP)，測得5 min內(nèi)PA率最大值。利用光學(xué)法PA檢測血小板的功能。根據(jù)徐旭等[4]提出的AR判斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)0.5 mmol/L花生四烯酸(AA)作為誘導(dǎo)劑，PA率≥20%；(2)10 μmol/L二磷酸腺苷(ADP)作為誘導(dǎo)劑，PA率≥70%。符合上述2項(xiàng)，為AR；符合1項(xiàng)者為ASP半抵抗(ASR)；2項(xiàng)均不符合為ASP敏感(AS)。按以上條件將患者分為AR組、ASR組及AS組。

1.2.2 單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析 利用QIAGEN公司提供的基因組DNA提取試劑盒提取血液標(biāo)本中的基因組DNA，并利用Thermo Fisher Scientific公司生產(chǎn)的NanoDrop2000cUV-Vis分光光度計(jì)進(jìn)行基因純度和定量鑒定。利用PRIME 5.0軟件設(shè)計(jì)COX-1、P2Y1、GPⅠa及GPⅢa基因擴(kuò)增的上、下游引物(見表1)。根據(jù)片段長度設(shè)置合適的擴(kuò)增時(shí)間和退火溫度，94 ℃變性1 min，45～60 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共40個循環(huán)，最后一循環(huán)后4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳分離純化后，送上海桑尼生物科技有限公司測序分析。

1.2.3 基因多態(tài)性檢測方法 COX-1、P2Y1、GPⅠa及GPⅢa基因中7個位點(diǎn)〔COX-1(A842G、C50T)、P2Y1(A1622G、C893T)〕、GPⅠa(C807T、G873A)、GPⅢa(T1565C)的多態(tài)性由SNP Analysis軟件直接讀出。

1.3 觀察指標(biāo) 比較3組患者一般資料及COX-1、P2Y1、GPⅠa、GPⅢa基因多態(tài)性。

2 結(jié)果

2.1 3組患者一般資料比較 AR組28例，ASR組71例，AS組144例。3組患者的年齡、性別、吸煙率、高血壓發(fā)生率、總膽固醇、三酰甘油和低密度脂蛋白水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表2、3)。3組患者糖尿病發(fā)生率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AS組患者糖尿病發(fā)生率低于AR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見表3)。

2.2 基因多態(tài)性位點(diǎn)等位基因分布頻率 243例患者中COX-1(A842G、C50T)、P2Y1(A1622G、C893T)、GPⅠa(C807T、 G873A)及GPⅢa(T1565C)4個基因中7個多態(tài)性位點(diǎn)的等位基因分布頻率見表4。

2.3 3組間COX-1、P2Y1、GPⅠa及GPⅢa基因多態(tài)性比較 3組間COX-1(842 A>G)、COX-1(50 C>T)、P2Y1(1622 A>G)、GPⅠa(873 G>A)、GPⅢa(1565 T>C)頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3組間P2Y1(893 C>T)和GPⅠa(807 C>T)頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AR組和ASR組P2Y1(893 C>T)、GPⅠa(807 C>T)頻率高于AS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見表5)。

表2 3組患者一般資料比較±s)

注：AR=阿司匹林抵抗，ASR=阿司匹林半抵抗，AS=阿司匹林敏感

表3 3組患者一般資料比較〔n(%)〕

注：與AR組比較，*P<0.01

表5 3組間COX-1、GPⅠa、GPⅢa及P2Y1基因多態(tài)性比較〔n(%)〕

注：與AS組比較，*P<0.01

表4 基因多態(tài)性位點(diǎn)等位基因分布頻率(%)

Table 4 The distribution of gene polymorphism alleles

基因多態(tài)性位點(diǎn)野生型等位基因及頻率突變型等位基因及頻率COX-1(842A>G)A448/486(922)G38/486(78)COX-1(50C>T)C456/486(938)T30/486(62)P2Y1(1622A>G)A441/486(907)G45/486(93)P2Y1(893C>T)C452/486(930)T34/486(70)GPⅠa(807C>T)C446/486(918)T40/486(82)GPⅠa(873G>A)G450/486(926)A36/486(74)GPⅢa(1565T>C)T454/486(934)C32/486(66)

3 討論

心腦血管疾病是目前威脅我國國民健康的頭號殺手，每年約有300萬人死于心血管疾病，約占死亡人口的1/3。ASP是目前治療心血管疾病公認(rèn)的有效藥物[4]，然而并非所有患者能從中受益。臨床實(shí)踐證明，部分患者對ASP的心血管保護(hù)作用反應(yīng)較差，即存在AR影響[3]。目前，越來越多的學(xué)者開始重視這一問題，但是對于AR的機(jī)制尚不清楚，可能與劑量和依從性、血小管旁路激活途徑和基因多態(tài)性相關(guān)。所有這些因素使機(jī)體對ASP的敏感性降低[5]。因此，研究基因多態(tài)性與AR發(fā)生的關(guān)系對于最終理解AR的機(jī)制具有重要的意義。

多項(xiàng)研究表明，遺傳因素在AR發(fā)生過程中起到重要作用，F(xiàn)araday等[6]的研究進(jìn)一步揭示，基因多態(tài)性及基因之間的相互作用能影響血小板對ASP治療的反應(yīng)。COX-1基因位點(diǎn)在本研究的患者中盡管發(fā)現(xiàn)多態(tài)性，但經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，其在AR組/ASR組中的攜帶率與AS組患者的攜帶率并無差異。這些位點(diǎn)的突變均為同義突變，因此對蛋白表達(dá)并不產(chǎn)生影響[7-8]，這可能是其與AR無關(guān)聯(lián)性的原因。

血小板GPⅠa/Ⅱa 復(fù)合物為膠原最初的受體，在血小板與受損血管病的黏附與聚集中發(fā)揮重要作用。研究顯示，807T等位基因與血小板膜上的GPⅠa/Ⅱa受體密度的增加顯著相關(guān)。受體密度不同，則血小板黏附于膠原的速度也不同，這表明一種潛在的血栓形成危險(xiǎn)因子可能在AR的發(fā)生中起到促進(jìn)作用。Moshfegh 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，807T/873A 等位基因純合子與急性心肌梗死的發(fā)生相關(guān)。大量研究提示，807T 等位基因與心肌梗死、腦梗死等血栓事件具有相關(guān)性[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，GPⅠa C807T 位點(diǎn)上，AR組及ASR組的T等位基因頻率高于AS組。說明ASP對于這類患者可能失效，并且其原因可能與血栓形成等因素有關(guān)。

GPⅢa與GPⅡb以非共價(jià)鍵結(jié)合構(gòu)成二聚體復(fù)合物，作為血小板膜上纖維蛋白原受體。GPⅡb/Ⅲa活化并與纖維蛋白原結(jié)合是引起PA的最終共同途徑。GPPⅢa聚乳酸(PLA)具有多態(tài)性，最常見的2個變型為亮氨酸(PLA1)、脯氨酸(PLA2)。GPPⅢa基因第2個外顯子核苷酸第1565位T被C所取代，使編碼的第33位PLA1被PLA2所取代[12]。這可能導(dǎo)致GPⅡb/Ⅲa受體結(jié)構(gòu)重要構(gòu)相改變，從而導(dǎo)致PA異常。

ADP受體P2Y1基因的相應(yīng)功能變化能夠改變ADP的信號功能[13-14]，降低對ASP的反應(yīng)性，從而導(dǎo)致血栓事件的產(chǎn)生[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，P2Y1 C893T位點(diǎn)上，AR組及ASR組T等位基因頻率高于AS組，提示P2Y1基因第893位點(diǎn)發(fā)生由T取代C后，變異導(dǎo)致帶有突變等位基因的患者AR極大增加，而P2Y1基因第1622位點(diǎn)中G取代A變異，并未對患者的AR造成顯著影響。

綜上所述，P2Y1(C893T)、GPⅠa(C807T)等位基因與AR相關(guān)，可能是遺傳易患因素。因此，對于存在上述變異的患者，其最終發(fā)生AR的可能性較野生型患者更高，臨床上開展個體化的SNP檢測，對于進(jìn)一步指導(dǎo)用藥治療具有重要價(jià)值。但本研究樣本量較少，干擾因素較多，因此還需做進(jìn)一步研究證明。

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修回日期：2015-03-13)

(本文編輯：李婷婷)

Correlation Between Aspirin Resistance and Gene Polymorphisms of COX-1,P2Y1,GPⅠa and GPⅢa

WANGLin，HUANGYong-gao，ZHANGYi-zhong，etal.

DepartmentofPharmacy,ZhejiangArmedPoliceCorpsHangzhouHospital，Hangzhou310051，China

Objective To investigate the correlation between polymorphisms of 7 sites in 4 genes COX-1 (A842G,C50T),P2Y1 (A1622G,C893T),GPⅠa (C807T,G873A) and GPⅢa (T1565C) and aspirin resistance (AR).Methods A total of 243 patients with atherosclerosis who were admitted to Department of Internal Medicine in Zhejiang Armed Police Corps Hangzhou Hospital during October 2011 to December 2013,were selected as study subjects,the platelet agglutination rate was detected,patients were divided into three groups:aspirin resistant (AR) group,aspirin semi-responder (ASR) group and aspirin sensitive (AS) group,genotype of COX-1,P2Y1,GPⅠa and GPⅢa was analyzed respectively.The general informations and gene polymorphisms of COX-1,P2Y1,GPⅠa,GPⅢa were compared among three groups of patients.Results AR group,ASR group and AS group included 28 cases,71 cases and 144 cases,respectively.There was no significant difference in age,gender,smoking rate,hypertension prevalence,total cholesterol level,triacylglycerol level and low density lipoprotein level among three groups of patients (P>0.05).There was significant difference in prevalence of diabetes mellitus among three groups of patients (P<0.01).Prevalence of diabetes mellitus of patients in AS group was significantly lower than that of patients in AR group (P<0.05).There was no significant difference in frequency of COX-1 (842 A>G),COX-1 (50 C>T),P2Y1(1622 A>G)，GPⅠa (873 G>A) and GPⅢa (1565 T>C) among three groups (P>0.05).There were significant differences in frequency of P2Y1(893 C>T) and GPⅠa (807 C>T) among three groups (P<0.05),and the frequency of P2Y1(893 C>T) and GPⅠa (807 C>T) in AR group and ASR group was significantly higher than that in AS group,respectively (P<0.01).Conclusion There are correlations between mutation of P2Y1(C893T),GPⅠa (C807T)alleles and aspirin resistance,which provides a reference for guiding the clinical medication.

Polymorphism,single nucleotide；Aspirin resistance；Platelet aggregation

310051浙江省杭州市，武警浙江省總隊(duì)杭州醫(yī)院藥劑科

王林，310051浙江省杭州市，武警浙江省總隊(duì)杭州醫(yī)院藥劑科；E-mail：wlwl182036@163.com

R 972

B

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.15.021

2014-12-21；