巨細(xì)胞病毒嵌合癌胚抗原介導(dǎo)單純皰疹病毒胸苷激酶聯(lián)合丙氧鳥苷自殺基因體系

王成興等

[摘要] 目的 觀察巨細(xì)胞病毒（CMV）嵌合以癌胚抗原為啟動子，以腺病毒為載體的單純皰疹病毒胸苷激酶基因重組構(gòu)建體Ad-CMV-CEA-HSV/TK聯(lián)合丙氧鳥苷（GCV）體內(nèi)抗結(jié)腸癌的療效。 方法 構(gòu)建人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型，按不同濃度梯度Ad-CMV-CEA-HSV/TK（1.0×109/kg、5.0×109/kg、10.0×109/kg）經(jīng)尾靜脈注射帶瘤小鼠后，腹腔注射相同濃度GCV（50 mg/kg），并設(shè)空白對照組及不同濃度的Ad-CEA-HSV/TK/GCV對照（1.0×109/kg、5.0×109/kg、10.0×109/kg），共設(shè)A～G 7組，每組各10只小鼠。觀察腫瘤體積、重量、腫瘤體積-時間曲線、腫瘤抑制率及生存期。 結(jié)果 Ad-CMV-CEA-HSV/TK/GCV及Ad-CEA-HSV/TK/GCV對人結(jié)腸癌裸鼠移植瘤生長均具有抑制作用，對移植瘤的體積及重量抑制呈作用物濃度依賴性；且Ad-CMV-CEA-HSV/TK/GCV抑制能力較Ad-CEA-HSV/TK/GCV顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 Ad-CMV-CEA-HSV/TK/GCV體系對結(jié)腸癌具有明確的實驗性治療作用，為人結(jié)腸癌及結(jié)腸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶的Ⅰ期臨床治療試驗提供科學(xué)實驗依據(jù)，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)腸癌；基因治療；巨細(xì)胞病毒；重組腺病毒；癌胚抗原

[中圖分類號] R735.35 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）06（b）-0013-04

Therapeutic effect of cytomegalovirus chimeric carcinoembryonic antigen promoter combined with HSV-TK/GCV system for human colon cancer

WANG Chengxin ZENG Shanqi YANG Ping ZHANG Tong WEI Jianchang CHEN Huacui CAO Jie

Department of Gastrointestinal Surgery， the Affiliated Guangzhou First People's Hospital of Guangzhou Medical University， Guangdong Province， Guangzhou 510180， China

[Abstract] Objective To approach the treatment efficiency of replication defective adenovirus carrying HSV/TK gene under control of the cytomegalovirus union carcinoembryonic antigen promoter and ganciclovir （GCV） in nude mice xenografts model of human colon cancer. Methods The model of human colon cancer xenografts in BALB/c nude mouse was builded successfully. After injection of different concentration gradient of Ad-CMV-CEA-HSV/TK （1.0×109/kg， 5.0×109/kg， 10.0×109/kg） in caudal vena， the same level of GCV （50 mg/kg） was given by peritoneal injection， and they were divided into the blank control group and Ad-CEA-HSV/TK control group with different concentration （1.0×109/kg， 5.0×109/kg， 10.0×109/kg） were set， in total of 7 groups， each group of 10 mice. The anti-tumor efficacy was analyzed by index of tumor volume， tumor weight， relative tumor curative， and tumor growth curve. Results After therapy， growth of human colon cancer xenografts in nude mouse were observably inhibited by Ad-CMV-CEA-HSV/TK/GCV and Ad-CEA-HSV/TK/GCV in a dose dependent， and there were no inhibition plateau. Ad-CMV-CEA-HSV/TK/GCV showed a stronger inhibition ability than Ad-CEA-HSV/TK/GCV （P < 0.05）. Conclusion Ad-CMV-CEA-HSV/TK/GCV system is highly experimental effective and safe to inhibit the growth of human colon cancer xenografts， provides scientific basis forⅠ period experimental of clinical treatment of human colon cancer and colon cancer distant metastases， and has a wide prospect of clinical application.

[Key words] Colon cancer； Gene therapy； Cytomegalovirus； Recombinant adenovirus； Carcinoembryonic antigen

結(jié)腸癌是嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病之一，在北美、歐洲和澳大利亞，結(jié)腸癌發(fā)病率在消化道腫瘤中位居第一位，是腫瘤相關(guān)死亡病例中的第二位原因[1]。近20年來我國結(jié)腸癌發(fā)病率呈上升趨勢，已經(jīng)發(fā)展成為常見惡性腫瘤中發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤[2]。傳統(tǒng)的結(jié)腸癌治療方案主要有手術(shù)治療、放療和化療，而這些療法或其聯(lián)合療法均不能達(dá)到令人滿意的結(jié)果。近年來，單純皰疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鳥苷（herpes simplex virus-thymidine kinase/ganciclovir，HSV-TK/GCV）自殺基因系統(tǒng)在腫瘤基因治療研究領(lǐng)域成為熱點[3-4]。本研究將驗證嵌合巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus，CMV）增強(qiáng)子的HSV-TK/GCV對腫瘤的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

PRMI1640培養(yǎng)液、10%滅活胎牛血清、鏈-青霉素抗體均購自美國GIBCO公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）購自美國Sigma公司；更昔洛韋（ganciclovir，GCV）購自湖北科益藥業(yè)有限公司。人類中分化結(jié)腸腺癌SW480細(xì)胞株由廣州醫(yī)科大學(xué)實驗中心細(xì)胞庫提供。癌胚抗原啟動子調(diào)控攜帶單純皰疹病毒胸苷激酶基因的重組腺病毒（herpes simplex virus-thymidine kinase/ganciclovir controlled by CEA promoter，Ad-CEA-HSV/TK）、CMV增強(qiáng)子嵌入、癌胚抗原啟動子調(diào)控攜帶HSV-TK基因的重組腺病毒（adenoviral mediated herpes simplex virus-thymidine kinase controlled by CMV-CEA promoter，Ad-CMV-CEA-HSV/TK）均由廣州醫(yī)科大學(xué)實驗中心提供技術(shù)支持構(gòu)建。按常規(guī)方法對重組腺病毒進(jìn)行擴(kuò)增、純化和滴度測定，并置于-80℃保存?zhèn)溆茫?～6周齡BALB/C裸鼠雌雄各35只，體重16～25 g，由中山大學(xué)實驗動物中心提供[許可證號：SCXK（粵）2009-0011，動物質(zhì)量合格證號：0081587]。

1.2 實驗方法

動物移植瘤模型的建立 取對數(shù)生長期SW480細(xì)胞，用0.25%胰酶及0.20%乙二胺四乙酸消化傳代，置于37℃含50% CO2恒溫箱中培養(yǎng)，收集并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107個/mL的細(xì)胞懸液，取0.2 mL接種于裸鼠背部皮下，注射點選擇左前背部皮下，待腫瘤長至直徑約1.0 cm。試驗裸鼠隨機(jī)分為7組，每組10只，各組處理見表1。

1.3 療效觀察

觀察3周，每隔1天測量1次腫瘤大小，計算腫瘤體積，腫瘤體積按公式計算：體積=長徑×短徑2×0.5236，比較各組間腫瘤體積變化。腫瘤抑制率=（1-實驗組平均重量/對照組平均重量）×100%，計算腫瘤生長抑制率并繪制生長曲線。實驗結(jié)束后將實驗動物寰椎脫離法處死，剝離瘤體，測量體積及瘤重。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組移植瘤體積比較

各組裸鼠皮下注射SW480細(xì)胞2～4 d均可觸及小結(jié)節(jié)狀移植瘤病灶，2周后腫瘤大小為1 cm，接種成功率為100%。就腫瘤生長情況而言，治療開始后A組腫瘤持續(xù)快速生長，至實驗結(jié)束時生存裸鼠移植瘤平均體積為（675.33±3.25）mm3；B、C、D組及E、F、G組腫瘤生長速度較A組明顯減緩，B、C、D組隨著藥物濃度升高腫瘤體積遞減，E、F、G組也呈相似變化，提示移植瘤體積與藥物濃度呈反比；E、F、G組移植瘤體積較B、C、D組移植瘤體積增長明顯減緩，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.001）。見圖1。

圖1 移植瘤體積生長曲線

2.2 動物移植瘤抑制效應(yīng)

B、C、G組治療對人結(jié)腸癌SW480裸鼠移植瘤的生長具有抑制作用，且瘤體體積及重量的抑制均呈濃度依賴性，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；E、F、G組瘤體體積及重量分別較B、C、D組小，抑瘤作用更明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；A組裸鼠自實驗開始3 d后出現(xiàn)死亡，實驗結(jié)束時存活3只，而B、C、D、E、F、G組分別存活7、7、8、8、7、9只，結(jié)果提示B、C、D、E、F、F、G組生存率較A組顯著提高，且E、F、G組生存率最明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。

表2 動物移植瘤抑制效應(yīng)（n = 10）

注：與B組比較，*P < 0.05；與C組比較，**P < 0.05；與D組比較，***P < 0.05

3 討論

惡性腫瘤的基因治療中，為了提高腫瘤組織特異性表達(dá)自殺基因TK或CD從而改善腺病毒自殺基因系統(tǒng)特異性或選擇性殺死腫瘤細(xì)胞，近年來對腺病毒載體進(jìn)行了改造，利用腫瘤組織特異性啟動子如癌胚抗原（CEA）啟動子，來驅(qū)動自殺基因表達(dá)[5-6]。因為CEA啟動子只在CEA蛋白陽性細(xì)胞中，如結(jié)腸癌細(xì)胞，有驅(qū)動活性，而在CEA蛋白陰性細(xì)胞，如成人正常細(xì)胞，沒有驅(qū)動活性。在正常情況下，CEA蛋白僅表達(dá)于胎兒組織，于成人組織CEA則不表達(dá)。然而，CEA蛋白則高表達(dá)于各種消化道惡性腫瘤組織中，如結(jié)腸癌幾乎100%表達(dá)CEA[7]。研究表明，利用CEA啟動子指導(dǎo)自殺基因表達(dá)已經(jīng)明顯提高殺傷腫瘤組織的特異性。然而這種CEA啟動子指導(dǎo)的自殺基因表達(dá)活性很低，有其顯著局限性[8]。有研究表明，CMV即刻早期基因的啟動子-增強(qiáng)子系統(tǒng)是目前所知的最強(qiáng)的增強(qiáng)子-啟動子系統(tǒng)，因而已廣泛應(yīng)用于各種真核表達(dá)載體中來驅(qū)動外源基因表達(dá)[9]。本研究將CMV增強(qiáng)子序列克隆至CEA啟動子序列上游以形成一種嵌合型CMV增強(qiáng)子-CEA啟動子，形成Ad-CMV-CEA-HSV/TK/GCV治療體系，與缺乏增強(qiáng)子的Ad-CMV-CEA-HSV/TK/GCV及空白對照的療效相比較，結(jié)果提示其不僅能保留CEA啟動子結(jié)腸癌組織特異性，又能通過CMV增強(qiáng)子極大地提高CEA啟動子驅(qū)動自殺基因表達(dá)的活性。

嵌合強(qiáng)效CMV增強(qiáng)子-CEA啟動子-TK基因重組腺病毒聯(lián)合GCV自殺基因治療體系（Ad-CMV-CEA-HSV/TK/GCV體系）的主要優(yōu)點包括[10-14]：①腫瘤組織選擇性。由于CEA高效表達(dá)于人結(jié)腸癌細(xì)胞而不表達(dá)于正常組織，因而該系統(tǒng)僅殺死CEA陽性的腫瘤細(xì)胞。②高效性。利用CMV增強(qiáng)子的高效性，來增強(qiáng)CEA啟動子指導(dǎo)的自殺基因的高效表達(dá)，克服傳統(tǒng)的腺病毒載體CEA啟動子活性低的缺陷。③安全性。由于本研究采用復(fù)制缺陷型腺病毒載體，因而感染細(xì)胞后不會引起腺病毒在體內(nèi)細(xì)胞中復(fù)制和感染擴(kuò)散。④“旁觀者”殺傷效應(yīng)。由于本研究所采用重組腺病毒介導(dǎo)的自殺基因聯(lián)合前藥來治療腫瘤，當(dāng)部分腫瘤細(xì)胞受到感染并被殺傷，臨近未被感染的腫瘤組織也被殺死，從而使該系統(tǒng)殺傷腫瘤細(xì)細(xì)胞效應(yīng)得到擴(kuò)大，稱之為“旁觀者”殺傷效應(yīng)。

Ad-CMV-CEA-HSV/TK/GCV體系克服了目前報道的病毒介導(dǎo)的自殺基因表達(dá)水平不高或缺乏腫瘤組織特異性的缺點。為人結(jié)腸癌及結(jié)腸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶的Ⅰ期臨床治療試驗提供科學(xué)實驗依據(jù)，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Shaukat A，Mongin SJ，Geisser MS，et al. Long-term mortality after screening for colorectal cancer [J]. N Engl J Med，2013，369（12）：1106-1114.

[2] 劉卓，宋冰，李小寒，等.結(jié)直腸癌篩查影響因素的研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2014，11（2）：41-43.

[3] Yin X，Yu B，Tang Z，et al. Bifidobacterium infantis-mediated HSV-TK/GCV suicide gene therapy induces both extrinsic and intrinsic apoptosis in a rat model of bladder cancer [J]. Cancer Gene Ther，2013，20（2）：77-81.

[4] Lin M，Huang J，Zhang J，et al. The therapeutic effect of PEI-Mn0.5Zn0.5Fe2O4 nanoparticles/pEgr1-HSV-TK/GCV associated with radiation and magnet-induced heating on hepatoma [J]. Nanoscale，2013，5（3）：991-1000.

[5] Xu C，Sun Y，Wang Y，et al. CEA promoter-regulated oncolytic adenovirus-mediated Hsp70 expression in immune gene therapy for pancreatic cancer [J]. Cancer Lett，2012， 319（2）：154-163.

[6] 殷祥瑞，唐偉，喻備，等.雙歧桿菌介導(dǎo)HSV-TK/GCV系統(tǒng)治療大鼠膀胱癌的療效[J].中國生物制品學(xué)雜志，2013， 26（4）：495-500.

[7] McKeown E，Nelson DW，Johnson EK，et al. Current approaches and challenges for monitoring treatment reesponse in colon and rectal cancer [J]. J Cancer，2014，5（1）：31-43.

[9] Long H，Li Q，Wang Y，et al. Effective combination gene therapy using CEACAM6-shRNA and the fusion suicide gene yCDglyTK for pancreatic carcinoma in vitro[J]. Exp Ther Med，2013，5（1）：155-161.

[10] 李洋，馬程遠(yuǎn)，里程楠，等.自殺基因系統(tǒng)HSV-TK/GCV聯(lián)合聲動力療法對人肺癌細(xì)胞NCI-446的體外殺傷實驗[J].腫瘤防治研究，2013，40（3）：226-231.

[11] Kim SW，Kim SJ，Park SH，et al. Complete regression of metastatic renal cell carcinoma by multiple injections of engineered mesenchymal stem cells expressing dodecameric TRAIL and HSV-TK [J]. Clin Cancer Res，2013， 19（2）：415-427.

[12] Pacholska A，Wirth T，Samaranayake H，et al. Increased invasion of malignant gliomas after 15-LO-1 and HSV-tk/ganciclovir combination gene therapy [J]. Cancer Gene Ther，2012，19（12）：870-874.

[13] Hung CF，Chiang AJ，Tsai HH，et al. Ovarian cancer gene therapy using HPV-16 pseudovirion carrying the HSV-tk gene [J]. PLoS One，2012，7（7）：e40983.

[14] Ahn YH，Yi H，Shin JY，et al. STAT3 silencing enhances the efficacy of the HSV.TK suicide gene in gastrointestinal cancer therapy [J]. Clin Exp Metastasis，2012，29（4）：359-369.

（收稿日期：2015-02-05 本文編輯：任 念）