綿羊乳突類圓線蟲病的診斷及蟲種鑒定

范國英 王順崗 陳桂香

摘要：對河南省新鄉(xiāng)市某羊場疑似乳突類圓線蟲病的綿羊進行了臨床檢查，取其糞便采用飽和鹽水漂浮法檢查，斯陶爾氏蟲卵計數(shù)法計數(shù)，幼蟲進行培養(yǎng)與鑒定等。結果表明，病羊糞便中有大量疑似乳突類圓線蟲蟲卵，對蟲卵培養(yǎng)后，根據(jù)幼蟲大小、蟲體形態(tài)學觀察確診為綿羊乳突類圓線蟲病。

關鍵詞：綿羊；乳突類圓線蟲??；診斷；幼蟲培養(yǎng)；蟲種鑒定

中圖分類號：S852.73+1；S858.26 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）10-2442-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.036

羊乳突類圓線蟲病是由類圓線蟲屬（Strongyloides stercoralis）中的乳突類圓線蟲（Strongyloides papillosus）所引起牛、羊等反芻動物的一種寄生蟲病?；荚摬〉难虺３Ｏ?、貧血、嘔吐、腹瀉，最后多因極度衰弱而死亡，死亡率可達50%[1]。乳突類圓線蟲只有孤雌生殖的雌蟲，目前未見有雄蟲寄生的報道。雌蟲身體細小，乳白色，口腔小，有兩片唇，食道簡單，陰門位于體后1/3與中1/3交界處，有兩片突出的小唇。孤雌生殖的雌蟲在終末宿主小腸產含有第一期幼蟲的蟲卵，并排到外界。在外界從蟲卵孵出第一期幼蟲。對該病的預防措施主要是在每年春秋兩季用丙硫咪唑驅蟲1～2 次。本研究對河南省新鄉(xiāng)市某羊場疑似乳突類圓線蟲病的綿羊進行了臨床檢查，糞便采用飽和鹽水漂浮法檢查，斯陶爾氏蟲卵計數(shù)法計數(shù)，幼蟲進行培養(yǎng)與鑒定等，最終確診該羊場羊只所患疾病為綿羊乳突類圓線蟲病。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試劑 食鹽、碘化鉀、碘等均為市售。各種溶液的配制，飽和鹽水、盧戈氏碘液配制方法參見文獻[2]。

無菌糞汁：取適量羊的新鮮糞便加入適量蒸餾水，攪拌使其混合均勻，然后用紗布濾去粗大的糞渣，濾液在火爐上煮沸2 h滅菌和殺蟲[3]。

1.1.2 試驗器材 SPX-150B智能型系列生化培養(yǎng)箱，上海將來實驗設備有限公司；WF10/18型顯微鏡，上海兆儀光電科技有限公司。260目錦綸篩兜等均為市售。

1.2 試驗方法

1.2.1 臨床檢查 采用病史調查、臨床基本檢查法等進行臨床檢查。

1.2.2 糞便的采集和厭氧保存 糞便采自河南省新鄉(xiāng)市某羊場的疑似乳突類圓線蟲病的綿羊。在100 mL的塑料杯中放入10粒左右直徑8 mm的玻璃珠，加入約85 mL的自來水。加入10 g新鮮糞便，擰緊瓶蓋，用力搖動1 min，使糞球破碎，瓶內糞便很快變?yōu)闊o氧狀態(tài)[3]。將瓶在20 ℃左右保存，7 d后可收集蟲卵用于試驗。

1.2.3 飽和鹽水漂浮法 取糞便10 g，加飽和鹽水100 mL，混勻，通過60目銅篩，濾入燒杯中，靜置0.5 h，蟲卵上浮，用一直徑5～10 mm的鐵絲圈，與液面平行接觸以沾取表面液膜，抖落于載玻片上加蓋玻片進行觀察，并測量其大小。同法制得載玻片上蟲卵經盧戈氏碘液染色后加蓋玻片顯微鏡下觀察。

1.2.4 斯陶爾氏蟲卵計數(shù)法（Stolls method） 在一小玻璃容器上（如小三角燒瓶或大試管），在容量56 mL和60 mL處各做一個標記，先取0.4%的NaOH溶液注入容器內至56 mL處，再加入被檢糞便使液體升到60 mL處，而后加入一些玻璃珠，振蕩使糞便完全破碎混勻，而后以1 mL的吸管吸取液體0.15 mL，滴于2～3張載玻片上，覆以蓋玻片，在顯微鏡下循序檢查，統(tǒng)計其中蟲卵總數(shù)（注意不可遺漏和重復）。因0.15 mL糞液中實際含原糞量是0.01 g，因此所得蟲卵總數(shù)乘以100即為每克糞便中的蟲卵數(shù)[4]。

1.2.5 幼蟲培養(yǎng)與蟲種鑒定

1）綿綸篩兜集卵法：參見文獻[4]。此法適用于長度大于60 μm的蟲卵，通過處理，粗大糞渣被銅篩扣留，纖細糞渣（直徑小于40 μm）和可溶性色素均被沖洗走而使蟲卵集中，本試驗收集濾液。

2）無菌糞汁法培養(yǎng)：將收集到的蟲卵液搖勻后，吸取2 mL于培養(yǎng)皿內，再吸取無菌糞汁0.2～0.5 mL于培養(yǎng)皿內，混勻后貼上標簽28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3）羊糞堆丘法培養(yǎng)：按Henriksen[5]、王慶良[6]的方法改良。將新鮮羊糞碾碎并加入適量鋸末，攪勻加入自來水保持其濕潤，在培養(yǎng)皿上放一張濾紙，將糞便裝填成錐形，即糞便樣品中間部分稍高于平皿水平面1～2 mm，四周低于平皿水平面10～15 mm，28 ℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

4）蟲種鑒定：蟲卵及幼蟲經盧戈氏碘液染色后加蓋玻片，顯微鏡下通過觀察其形態(tài)、大小等進行鑒定。

2 結果與分析

2.1 臨床檢查結果

臨床可見病羊有不同程度的貧血、消瘦、腹瀉癥狀，感染性幼蟲穿過皮膚移行到肺時，常引起濕疹、支氣管炎、肺炎和胸膜炎，最后多因極度衰弱而死亡，死亡率可達50%；少量寄生時，臨床癥狀不明顯，但影響生長發(fā)育。絲蟲蚴侵入成年羊體內時常不能發(fā)育至性成熟，但病羊及年老體弱羊有時感染。

2.2 飽和鹽水漂浮法檢查結果

2.2.1 蟲卵形態(tài) 蟲卵形態(tài)見圖1、圖2。顯微鏡下觀察到大量蟲卵，蟲卵為橢圓形，殼薄，無色透明，蟲卵大小為（42～60） μm ×（25～36） μm，且大部分蟲卵內含幼胚。

2.2.2 蟲卵大小 顯微鏡下觀察蟲體的大小有很大差異，其結果見表1。由表1可知，羊糞中長度小于60 μm的蟲卵較多，占42%；且蟲卵中含有幼胚，初步診斷為乳突類圓線蟲。

2.3 斯陶爾氏蟲卵計數(shù)法結果

斯陶爾氏蟲卵計數(shù)結果顯示每克羊糞中含蟲卵1 100個，屬于輕度感染。

2.4 幼蟲培養(yǎng)和蟲種鑒定結果

采用無菌糞汁法、羊糞堆丘法在28 ℃的條件下培養(yǎng)2～3 d均觀察到大量幼蟲，運動活潑。染色后具體的形態(tài)學觀察結果見圖3。根據(jù)以上形態(tài)學觀察結果，最終確診為綿羊乳突類圓線蟲病。

3 小結與討論

3.1 病料采集與幼蟲的培養(yǎng)

根據(jù)臨床癥狀觀察以及對所分離的蟲卵、孵化的幼蟲蟲體進行形態(tài)學的檢測，確認該羊場的羊只所患為乳突類圓線蟲病。為了保證試驗結果的準確性，蟲卵孵化試驗中的蟲卵必須在從宿主體內排出后3 h內使用；蟲卵只能在2～7 ℃保存，否則會影響卵的孵化過程。因為蟲卵孵化試驗要用新鮮的蟲卵，故在野外調查時難度較大。綿羊和山羊糞便中的線蟲卵保存通過糞樣的厭氧保存可以得到解決[7]。

糞便中的乳突類圓線蟲卵大多數(shù)在25 ℃溫水中經24 h發(fā)育為桿蟲型幼蟲，該幼蟲非?；钴S，將含有該幼蟲的羊糞便經貝爾曼氏幼蟲分離時，幼蟲在數(shù)秒鐘內大多進入水中，并向試管下移動[8，9]。如果羊糞便中混雜有其他線蟲的幼蟲，因是第一期幼蟲，運動很慢，在數(shù)秒鐘內很少能進入水中，即使進入水中，其沉向試管底的時間也較長。因此本試驗在1 min內收集的大多為類圓線蟲的幼蟲。此外類圓線蟲絲蟲型幼蟲形態(tài)特異，其尾部有分叉，容易與其他的幼蟲區(qū)別。集卵后用無菌糞汁進行培養(yǎng)，培養(yǎng)皿底部放一平皿加水來調節(jié)濕度，這樣就可以少加糞汁，并且注意間隔一定的時間向培養(yǎng)皿內吹新鮮空氣[10]。

本試驗中羊糞堆丘法用鋸末加糞便進行培養(yǎng)不僅可使培養(yǎng)物疏松通氣，而且木質的吸水性具有調節(jié)培養(yǎng)物濕度的功能，從而保證蟲卵發(fā)育時所需的空氣和水分，進一步提高蟲卵發(fā)育率。

3.2 乳突類圓線蟲發(fā)病季節(jié)特征

乳突類線圓蟲蟲卵一年內在羊糞中出現(xiàn)有2個高峰，第一個高峰期在10月，第二個高峰期在5月。蟲卵出現(xiàn)的低谷在12月至次年的3月，即整個冬季[11]。本試驗中羊糞中的乳突類圓線蟲蟲卵處于第二個高峰期，這也是做出診斷的依據(jù)之一。據(jù)此規(guī)律，羊場宜在每年春、秋兩季用丙硫咪唑驅蟲1～2 次，可有效預防該病。

參考文獻：

[1] 孔繁瑤.家畜寄生蟲學[M].第二版.北京：中國農業(yè)大學出版社，1997.

[2] 趙樹英.動物寄生蟲學[M].第三版.山西太谷：山西農業(yè)大學出版社，2005.

[3] COLES G C，何國聲.世界獸醫(yī)寄生蟲學促進協(xié)會（WAAVP）對驅蠕蟲藥抗藥性的檢測方法[J].中國獸醫(yī)寄生蟲病，1996（1）：60-63.

[4]嚴若峰，徐立新，李祥瑞.捻轉血矛線蟲純凈3期幼蟲制備方法的改進[J].畜牧與獸醫(yī)，2009（1）：86-88.

[5] HENRIKSEN S A.A method for culture and recovery of gastrontestinal wtrongyle larvae[J].Nord Veter，1983，35：429-430.

[6] 王慶賢.馬圓線蟲類幼蟲培養(yǎng)方法的改進及溫度、濕度對幼蟲發(fā)育的影響[J].中國獸醫(yī)雜志，1959（7）：217-220.

[7] 張西臣，李建華.動物寄生蟲病學[M].北京：科學出版社，2009.

[8] 姚寶安，王乾蘭.蘇云金芽孢桿菌毒素對羊捻轉血矛線蟲第三期幼蟲毒力研究[J].畜牧獸醫(yī)學報，1995，26（4）：358-361.

[9] 葉明忠，沈 杰，陳永軍.羊乳突類圓線蟲在體內及牧場上消長規(guī)律的研究[J].湖北畜牧獸醫(yī)，1994（2）：13-15.

[10] 韓 謙.蒙古馬歇爾線蟲人工培養(yǎng)及其發(fā)育各階段的形態(tài)學研究[D].北京：北京農業(yè)大學，1988.

[11] 王治才，徐志光，李建軍，等.綿羊糞便中毛圓線蟲卵培養(yǎng)和感染性幼蟲分離法的比較[J].中國獸醫(yī)寄生蟲病，2004，12（2）：4-6.