銅基殺菌劑對柑橘炭疽病菌的室內(nèi)毒力測定

郭洋洋 張宇宏 毛潤乾 鄭基煥

摘要：為確定銅基殺菌劑防治柑橘炭疽?。–olletotrichum gloeosporioides）的潛力，采用水平擴散法和生長速率法對3種銅基殺菌劑進行了室內(nèi)毒力測定。結(jié)果表明，生長速率法可定量測定這3種銅基殺菌劑的毒力；77%氫氧化銅和30%琥膠肥酸銅在設(shè)定濃度完全抑制柑橘炭疽病生長，95%葡萄糖酸銅對柑橘炭疽病菌的抑制中濃度EC50=1.62 g/L，濃度不小于8 g/L時，可完全抑制柑橘炭疽病菌的生長。因此，3種銅基殺菌劑皆有防治柑橘炭疽病的潛力。

關(guān)鍵詞：柑橘炭疽?。–olletotrichum gloeosporioides）；銅基殺菌劑；毒力測定

中圖分類號：S482.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）10-2384-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.020

柑橘炭疽?。–olletotrichum gloeosporioides）是一種普遍發(fā)生的真菌性病害，該病可為害柑橘樹的葉、梢、花、果，不僅能引起田間的葉斑、落葉、枯梢、落果，還可以導(dǎo)致植株各器官的潛伏性侵染，嚴重影響樹勢和果實的產(chǎn)量與品質(zhì)[1，2]。目前，防治柑橘炭疽病主要依靠化學(xué)防治，生產(chǎn)上多用苯并咪唑類和取代苯類殺菌劑[3，4]。但是，多年連續(xù)使用此類殺菌劑，炭疽病菌已對其產(chǎn)生了抗藥性，防治效果不斷下降[5，6]。因此，篩選出針對柑橘炭疽病的新型殺菌劑顯得非常迫切。

銅基殺菌劑可通過釋放銅離子殺滅病菌，是防治常見細菌和真菌性病害的一種理想藥劑[7，8]。但要確定其是否可以用于防治柑橘炭疽病，首先要進行室內(nèi)毒力水平的生物測定[9]。為此，用水平擴散法和生長速率法對3種銅基殺菌劑的毒力進行了測定，以期確定銅基殺菌劑用于防治柑橘炭疽病的潛力，為后續(xù)的大田試驗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株由廣西柑橘研究所采集病株，分離獲得。經(jīng)鑒定，其病原菌為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz.），鑒定方式為培養(yǎng)性狀和形態(tài)學(xué)特征觀測[10]。

1.2 試驗藥劑

本試驗采用3種銅基殺菌劑，分別為77%氫氧化銅，美國杜邦公司生產(chǎn)，商品名為可殺得；30%琥膠肥酸銅，由廣東省昆蟲研究所下屬公司羅定市生物化工有限公司生產(chǎn)提供，商品名為潰枯靈；95%葡萄糖酸銅原粉，由北京信諾科美科技有限公司提供。供試真菌的培養(yǎng)與保存均使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基。

1.3 室內(nèi)毒力測定

目前常用的室內(nèi)毒力測定方法主要有水平擴散法和生長速率法[11，12]，其主要原理是將殺菌物質(zhì)作用于細菌、真菌或其他病原微生物，根據(jù)抑制作用大小來判斷藥劑的毒力。

1.3.1 水平擴散法

1）殺菌劑的濃度梯度制作：準備無菌三角瓶，將殺菌劑按比例稀釋成不同的濃度梯度，每種藥劑設(shè)定20、40、60、80和100 g/L 5個濃度。

2）接菌：在超凈臺中，用接種針從供試菌的試管中挑取帶有柑橘炭疽病菌的菌塊，均勻點接到含PDA培養(yǎng)基15 mL、直徑為20 cm的培養(yǎng)皿中。然后用打孔器打取濾紙片（直徑5 mm）分別投入到配制好的供試藥劑稀釋液中吸附1 min，取出并將其靠在無菌的燒杯壁上，淌落多余的藥液后移入凝固的培養(yǎng)基表面，每一培養(yǎng)皿對角排列放入4片吸附同一濃度藥液的濾紙片，中央放一片吸附無菌水的空白濾紙。迅速蓋上培養(yǎng)皿，用封條密封，在恒溫培養(yǎng)箱中27～28 ℃培養(yǎng)24～48 h后觀察結(jié)果。

1.3.2 生長速率法

1）病原菌的純培養(yǎng)：在超凈臺中，用接種針從供試菌的試管中挑取帶有柑橘炭疽病菌的菌塊，點接到含PDA培養(yǎng)基15 mL、直徑為 20 cm的培養(yǎng)皿中，迅速蓋上培養(yǎng)皿，用封條密封，在恒溫培養(yǎng)箱中27～28 ℃培養(yǎng)。當(dāng)菌落分布均勻后，用無菌打孔器（內(nèi)徑5 mm）打孔，得到直徑為0.5 mm的小菌餅。

2）含藥培養(yǎng)基的制作：準備無菌三角瓶，將殺菌劑按比例稀釋成不同的濃度梯度，在培養(yǎng)皿中加入上述的藥液1 mL，然后再加入9 mL的PDA培養(yǎng)基，搖勻。每種藥劑設(shè)定20、40、60、80和100 g/L 5個濃度。

3）殺菌劑毒力測定：將打制好的菌餅移入帶藥培養(yǎng)基平板，每一培養(yǎng)皿對角排列放入4個菌餅，同時設(shè)空白對照。

4）置于27～28 ℃恒溫箱培養(yǎng)24～48 h，分別測定每個菌餅擴散的菌落直徑。

5）根據(jù)殺菌劑濃度與供試菌的關(guān)系曲線，求得各殺菌劑濃度與抑制機率值間的毒力回歸方程，再通過回歸方程計算出各殺菌劑的EC50值。

1.4 數(shù)據(jù)測量與統(tǒng)計分析

用直尺十字交叉測量菌落的直徑，以殺菌劑濃度的對數(shù)值為自變量，抑菌率的機率值為因變量，以最小二乘法建立毒力回歸方程，求出各藥劑的有效中量（EC50）。

2 結(jié)果與分析

2.1 水平擴散法試驗結(jié)果

瓊脂紙片擴散法的試驗結(jié)果表明，3種銅基殺菌劑對菌絲生長均有抑制作用，但抑制形成的抑菌圈不呈規(guī)則的圓形，只能定性看出它們之間的差異。因此，此法不適合用于室內(nèi)定量判斷銅基殺菌劑對柑橘炭疽病菌的毒力（圖1—圖3）。

2.2 生長速率法試驗結(jié)果

生長速率法的試驗結(jié)果表明，柑橘炭疽病菌在加有設(shè)定濃度的77%氫氧化銅和30%琥膠肥酸銅的培養(yǎng)皿內(nèi)生長均被完全抑制，95%葡萄糖酸銅對柑橘炭疽病毒力效果如圖4。

測定每個菌餅擴散的菌落直徑如表1，95%葡萄糖酸銅配制濃度20、40、60、80、100 g/L時，各濃度抑菌圈直徑平均值分別為24.80、17.80、12.10、5.00和5.00 mm；抑制率分別為72%、88%、96%、100%和100%，機率值為5.582 8、6.175 0、6.750 7、8.091 2和8.091 2（表1）。由此可以得出毒力曲線（圖5）。

經(jīng)計算，95%葡萄糖酸銅對柑橘炭疽病菌的抑制中濃度EC50=1.62 g/L，即為1 620 mg/L。95%葡萄糖酸銅對柑橘炭疽病菌毒力作用曲線方程為：y=3.875 6x+4.159 69，R2=0.895 951，P=0.014 7。

其中，x為95%葡萄糖酸銅濃度對數(shù)；y為95%葡萄糖酸銅對柑橘炭疽病菌的抑制機率值；R2為擬合優(yōu)度；P為0.05顯著水平時解釋變量的回歸系數(shù)顯著性t檢驗對應(yīng)值，P<0.05，證明模型的線性關(guān)系顯著（表1，圖5）。

3 小結(jié)與討論

目前，銅基殺菌劑已被用于防治多種細菌和真菌性病害，而且常與殺蟲劑和其他殺菌劑混配，以達到減少農(nóng)藥用量、降低污染和減少成本的目的[13，14]。文中所述銅基殺菌劑中，氫氧化銅為無機銅殺菌劑，琥膠肥酸銅和葡萄糖酸銅為有機銅殺菌劑。其中，無機銅殺菌劑在使用中存在不能與酸性農(nóng)藥混配、易引起螨類和蚧殼蟲猖獗和花期及幼果期易產(chǎn)生要害等不足[15]。而有機銅殺菌劑不僅兼有無機銅基殺菌劑傳統(tǒng)優(yōu)勢，還有易自然降解、不傷害天敵“多毛菌”和與農(nóng)藥親和性好等優(yōu)勢。因此，某些有機銅基殺菌劑可能成為新一代殺菌劑的最佳選擇。

試驗結(jié)果表明，77%氫氧化銅、30%琥膠肥酸銅和95%葡萄糖酸銅對柑橘炭疽病菌都有很強的抑制力。當(dāng)3種銅基殺菌劑設(shè)定為20、40、60、80和100 g/L時，水平擴散法只能定性其對柑橘炭疽病菌的毒力。當(dāng)用生長速率法試驗時，77%氫氧化銅和30%琥膠肥酸銅在設(shè)定濃度梯度可完全抑制柑橘炭疽病菌的生長，無法做出相應(yīng)毒力曲線，95%葡萄糖酸銅對柑橘炭疽病菌的抑制中濃度EC50=1.62 g/L，濃度不小于8 g/L時，可完全抑制柑橘炭疽病菌的生長。因此，以上3種銅基殺菌劑都可用于防治柑橘炭疽病，其中30%琥膠肥酸銅為首選。但是，室內(nèi)環(huán)境條件與大田應(yīng)用差異很大，故殺菌劑的室內(nèi)毒力測定僅可作為新型藥劑篩選的初步標準，田間應(yīng)用還需可靠的大田試驗。

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