多菌靈降解菌的鑒定及降解條件初步優(yōu)化

徐惠娟　胡典典　張虹

摘要：對已分離到的多菌靈降解菌進(jìn)行16S rDNA序列分析后，采用均勻設(shè)計法，優(yōu)化多菌靈降解菌降解條件。用4因素6水平混合均勻設(shè)計表，綜合考察培養(yǎng)時間、接種量、pH、溫度對多菌靈降解菌降解能力的影響。通過二次多項式逐步回歸得出最終降解條件為：培養(yǎng)時間6 d、接種量10%、pH 4.0、溫度為45 ℃時，最優(yōu)目標(biāo)函數(shù)Y（降解率）為68.65%。進(jìn)一步進(jìn)行盆栽試驗，檢測該菌在實際應(yīng)用中的降解效率為59.54%。

關(guān)鍵詞：多菌靈降解菌；均勻設(shè)計；降解條件優(yōu)化；盆栽試驗

中圖分類號：Q939.9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）10-2372-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.10.016

多菌靈是一種高效廣譜低毒的內(nèi)吸性殺菌劑，廣泛應(yīng)用于工業(yè)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，主要用于水果保鮮、蔬菜、果樹和谷類作物的真菌病害防治[1]。多菌靈化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定且降解半衰期長，在果蔬及土壤中的殘留能對生態(tài)環(huán)境和人、畜健康造成極大危害[2]。利用生物降解法去除多菌靈殘留已成為熱點。本研究運用均勻試驗設(shè)計的方法，多因素多水平地優(yōu)化多菌靈降解菌對多菌靈的降解條件，評估降解菌的降解能力，為實現(xiàn)多菌靈殘留去除的生物修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

試驗菌株從長期噴灑多菌靈的花卉基質(zhì)土中分離純化得到，保存于實驗室內(nèi)。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品由Adamas公司生產(chǎn)，純度為98%，80%多菌靈懸浮劑為蘇州遍凈植保科技有限公司生產(chǎn)。

種子培養(yǎng)基參考文獻(xiàn)[3]，降解培養(yǎng)基為NaCl 100 mg，K2HPO4 150 mg，KH2PO4 50 mg，MgSO4·7H2O 20 mg，（NH4）2SO4 200 mg，多菌靈20 mg，去離子水 100 mL。pH依需要調(diào)節(jié)。

1.3 菌株鑒定

將菌株充分活化后進(jìn)行菌體形態(tài)觀察和革蘭氏染色。提取細(xì)菌基因組DNA，PCR擴增16S rDNA，PCR產(chǎn)物純化后送上海生工生物工程有限公司測序，測序數(shù)據(jù)在NCBI上進(jìn)行BLAST比對分析。

1.4 均勻設(shè)計及數(shù)據(jù)分析

選用均勻設(shè)計試驗方案，擬選4因素，即培養(yǎng)時間（X1）、接種量（X2）、pH（X3）、溫度（X4）（圖1），每個處理重復(fù)5次，測定不同因素條件下多菌靈降解菌對多菌靈的降解能力，采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)分析所得數(shù)據(jù)，對多菌靈降解率進(jìn)行優(yōu)化求解，建立菌株對多菌靈的最佳降解力模型，預(yù)測最佳值。

1.5 盆栽試驗

1.5.1 小白菜的預(yù)處理 種植7盆小白菜，其中試驗組3盆，對照組4盆。按市售多菌靈使用說明配制多菌靈懸浮劑，將所配藥劑等份均勻噴灑到試驗組與對照組的小白菜莖及葉表面，早晚各處理一次，每次每盆20 mL。連續(xù)處理2 d，第3天開始用生長于對數(shù)期的菌液處理小白菜，每盆菌液20 mL，對照不噴菌。噴菌后第3、5、7天采樣進(jìn)行多菌靈殘留測定。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與樣品的提取分離 參考于彥彬等[4]測量多菌靈殘留量的方法，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和樣品多菌靈殘留量測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

在牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上進(jìn)行菌株djj-1活化培養(yǎng)24 h后觀察，菌落較小，奶白色，表面光滑，濕潤，呈圓形。顯微鏡下觀察菌體為桿狀，單個存在或成對存在，靜止期呈球形，革蘭氏染色為革蘭氏陰性菌。

將菌株djj-1的16S rDNA序列在NCBI上進(jìn)行序列比對分析和同源性比較，發(fā)現(xiàn)其與Acinetobacter baumannii的同源性達(dá)99%。

2.2 降解菌的降解條件優(yōu)化

采用三波長校正法對均勻設(shè)計的每個試驗處理進(jìn)行多菌靈降解率的測定，結(jié)果見圖1。

采用偏最小二乘回歸法（Partial Least Squares，PLS）[5]，以培養(yǎng)時間（X1）、接種量（X2）、pH（X3）、溫度（X4）為自變量；以降解率（Y）為因變量建立回歸方程如下：

Y=56.298 4-1.150 6X1-7.162 0X2+1.567 2X3-0.055 1X4-0.416 1X12+0.202 8X22+0.005 1X33- 0.003 7X44+0.5352 7X1X2+0.238 4X1X3+0.002 7X1X4-0.243 6X2X3+0.156 4X2X4-0.056 0X3X4

回歸方程Y的決定系數(shù)R2為0.865 3，經(jīng)F檢驗P<0.01，表明回歸方程的擬合程度較好。

為了尋求在試驗條件下獲得最大降解率，通過DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對回歸方程Y進(jìn)行優(yōu)化求解，得到各個試驗因素的最優(yōu)組合：X1為6，X2為10，X3為4，X4為45，即培養(yǎng)時間為6 d、接種量為10%、pH 4.0、溫度45 ℃時，最優(yōu)目標(biāo)函數(shù)Y（降解率）為68.65%。

2.3 多菌靈降解菌株的初步應(yīng)用分析

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 參照多菌靈標(biāo)準(zhǔn)曲線[4，6]的測定步驟， 測定不同含量多菌靈的三波長校正吸光度ΔA， 以校正吸光度ΔA為縱坐標(biāo)，多菌靈的含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在0～50 μg濃度范圍內(nèi)，曲線的回歸方程為Y= 0.001 5-0.000 8X（μg），Y為校正吸光度ΔA，相關(guān)系數(shù)為0.999 5。

2.3.2 樣品的測定結(jié)果 對處理后的小白菜進(jìn)行多菌靈殘留量的測定，根據(jù)數(shù)據(jù)計算得最大降解率為59.54%（表2），在理想最優(yōu)目標(biāo)函數(shù)（降解率）68.65%以內(nèi)。

3 小結(jié)與討論

微生物法是消除環(huán)境中多菌靈農(nóng)藥污染的有效手段，因此，選育和應(yīng)用高效多菌靈降解菌是多菌靈環(huán)境污染實現(xiàn)高效處理的重要措施。本研究將多菌靈降解菌經(jīng)多次分離純化后，對其進(jìn)行16S rDNA序列分析，發(fā)現(xiàn)與Acinetobacter baumannii的同源性達(dá)99%。

菌株對多菌靈的降解容易受到多種因素的限制，包括多菌靈的濃度、培養(yǎng)時間、pH、溫度及金屬離子等。目前對多菌靈降解菌的研究多局限在實驗室試驗單因素水平降解率方面，本研究應(yīng)用均勻試驗設(shè)計方法，從多因素、多水平研究微生物降解多菌靈的能力，優(yōu)化菌株djj-1對多菌靈的降解條件。結(jié)果表明，在其最優(yōu)條件下，即培養(yǎng)時間6 d、接種量為10%、pH 4.0、溫度45 ℃時，降解率為68.65%。

本試驗采用分光光度法進(jìn)行了小白菜中多菌靈殘留量的測定。結(jié)果表明，多菌靈菌株對小白菜中多菌靈最大降解率為59.54%，其結(jié)果較為滿意，但本試驗只是研究了菌株對盆栽小白菜多菌靈的降解作用，實驗室中的溫度相對適中，晝夜溫差不大，無陽光暴曬等環(huán)境因素的影響。如果將降解菌在戶外蔬菜田中應(yīng)用，對多菌靈的降解能力如何尚有待進(jìn)一步研究。

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