竹葉黃酮類物質(zhì)的抗氧化性能研究

陳 宇，董映雪，鄭 璐,盧智城

（莆田學(xué)院 環(huán)境與生物工程學(xué)院，福建 莆田 351100）

近年來，人們對人工合成的抗氧化劑越來越不信任而轉(zhuǎn)向?qū)邆涓咝Аo毒、安全等特點的天然抗氧化劑的開發(fā)和研究上.竹子，在中國是最主要的植物之一，有著漫長的藥、食兩用的歷史，在開發(fā)中醫(yī)藥和保健品方面有很高的價值.竹子資源豐富，但我國現(xiàn)今對其開發(fā)利用的情況較差[1].竹葉含有大量的黃酮類化合物，另外還含有生物多糖、氨基酸、活性肽等微量元素[2-3].有研究表明竹葉提取物具有顯著的抗氧化、抗疲勞、降血脂等作用[4-7].所以在未來的市場發(fā)展中，竹葉黃酮類物質(zhì)的應(yīng)用將占據(jù)極大的市場優(yōu)勢，極大的市場開發(fā)潛力.本文以莆田學(xué)院校園內(nèi)的竹子葉片為材料，測定竹葉黃酮的抗氧化性能，為竹子的綜合開發(fā)利用提供參考.

1 材料與方法

1.1 供試材料

將“佛肚竹”的竹葉（采自莆田學(xué)院芳名湖畔）清洗干凈，于50.0℃的烘箱中烘干.置于絞碎機中絞碎后，經(jīng)80目篩子過篩，稱取5.0000g的竹葉粉末，濾紙包好.在料液比為1:20（60%的乙醇溶液），溫度為60.0℃的水浴條件下加熱4h，得到竹葉的浸取液.60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)對竹葉浸取液進行濃縮，接著用石油醚對濃縮液進行萃取以除去葉綠素，將除去葉綠素的濃縮液定容成50mL，過濾，留待備用[8].

用乙醇溶液（同上提取竹葉提取液所用的溶劑）配制0.200mg·mL-1的蘆丁溶液.稱取5.0000g的NaNO2于100mL的容量瓶中用蒸餾水定容，配成5%的NaNO2溶液.稱取8.8000g的Al(NO3)3于100mL的容量瓶中用蒸餾水定容，配成5%的Al(NO3)3溶液.稱取10.0000g的NaOH于100mL的容量瓶中用蒸餾水定容，配成10%的NaOH溶液，備用.

根據(jù)陳宇等[9]前期實驗基礎(chǔ)得到竹葉提取液的黃酮類物質(zhì)的總濃度C=0.0224g·L-1.稱取0.2240g的抗壞血酸和BHT，以60%的乙醇溶液為溶劑將其定容到100mL的容量瓶中，配成濃度C=2.24g·L-1的溶液，使用時稀釋100倍.

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1試劑

鄰苯三酚、鹽酸、1,10-菲啰啉、三羥甲基胺基甲烷（Tris）、過氧化氫、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、硝酸鋁、2，6二叔丁基對甲酚、抗壞血酸、亞硝酸鈉、石油醚、無水乙醇等均為分析純.DPPH為生物試劑，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（99%，鄭州荔諾生物科技有限公司）.

1.2.2 主要儀器

BS224S電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；722型分光光度計（上海光譜儀器有限公司制造）；RE52CS-2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；DGH-9246電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；PHS-25酸度計（上海偉業(yè)儀器廠）.

1.3 測定項目與方法

1.3.1 對有機自由基（DPPH）的清除能力的實驗

用無水乙醇配制濃度為 0.26mmol·L-1的DPPH溶液，在冰箱中避光保存.實驗時稀釋至6.5×10-5mol·L-1的 DPPH溶液[10].

分別取 6.5×10-5mol·L-1的 DPPH乙醇溶液5mL+乙醇1mL、5mL的DPPH溶液+竹葉黃酮提取 液（100μL、200μL、400μL、600μL、800μL）、5mL乙醇+100μL竹葉黃酮提取液于試管中，定容混合均勻后室溫避光反應(yīng)10min后于517nm處測其吸光度，分別記為 A0、Ai、Aj.用抗壞血酸和 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）作比較.所有測定平行進行三次.

所得的吸光度代入下式計算提取液對有機自由基（DPPH）的清除率.

清除率=1-(Ai-Aj)/A0

1.3.2 對羥基自由基清除能力的實驗

本實驗采用Fenton反應(yīng)分光光度比色法來測定.參照羅宇倩的方法略有改動[11].

配制1.5mmol·L-1的鄰二氮菲溶液、磷酸鹽緩沖溶液 PBS（pH=7.24）、1.5mmol·L-1的硫酸亞鐵溶液、0.02%的過氧化氫溶液，備用.

取5只比色管，分別標(biāo)記為損1、未損1、空參1、樣1、樣參1.分別在損1、未損1和樣1中加入1 mL的鄰二氮菲和1mL的硫酸亞鐵溶液；接著在各個試管中加入2mL的PBS；在樣1和樣參1中分別加入200μL的竹葉提取液；最后分別量取1mL的過氧化氫加到損1和樣1中，蒸餾水定容.搖勻，靜置一段時間后，在536nm處測其吸光度.分別記為 A樣、A損、A未損.

同理分別測定當(dāng)竹葉提取液加入的量不同（0.2mL、0.5mL、1mL、2mL）時的吸光度.

所得的吸光度代入下式計算提取液對羥基自由基的清除率.

清除率=（A樣-A損）/(A未損-A損)

1.3.3 對超氧陰離子自由基清除能力的實驗

根據(jù)李鵬婧等[12]的方法略做改動.配制Tris-HCl溶 液 （50mmol·L-1，pH分 別 為 7.24、8.15、9.19），Tris溶液（50mmol·L-1，pH為 10.23），3mmol·L-1的鄰苯三酚溶液，備用.

取四支試管，分別標(biāo)記為空7.24、空參7.24、樣7.24、樣參7.24.先在四支試管中加入pH=7.24的Tris-HCl溶液各5mL；在空7.24試管中加入1.5mL的蒸餾水，空參7.24試管中加入2mL，樣7.24試管中加入1.3mL的蒸餾水，空參7.24試管中加入1.8mL的蒸餾水；接著在樣7.24和樣參7.24試管中分別加入0.2mL的竹葉提取液，搖勻，靜置一段時間.然后在空7.24和樣7.24分別迅速加入0.5mL的鄰苯三酚，計時，搖勻，每30s測定吸光度.分別記為A空、A樣.

不同pH值的Tris-HCl溶液（pH分別為7.24、8.15、9.19、），Tris溶液（pH為 10.23）步驟同上，測定吸光度.

確定最佳的pH值的Tris-HCl溶液，配制溶液并同理分別測定當(dāng)竹葉提取液加入的量不同（0.00mL、0.03mL、0.05mL、0.10mL、0.15mL、0.20mL）時的吸光度.

所得的吸光度代入下式計算提取液對超氧陰離子自由基的清除率.

清除率=（A空-A樣）/A空

2 結(jié)果與分析

2.1 竹葉黃酮類物質(zhì)對DPPH自由基的清除能力

2.1.1 不同抗氧化劑對DPPH自由基的清除效果的影響

由圖1可以看出隨著抗氧化劑加入量的增加，溶液的吸光度總體的趨勢都是降低的.其中竹葉提取液即竹葉黃酮類化合物對DPPH自由基的清除作用是最明顯的.從圖1還可以看出的是竹葉黃酮類化合物的加入量在0.2mL的時候就已經(jīng)有顯著的清除效果，隨著竹葉黃酮類化合物的加入量的增多，溶液的吸光度A趨向于0.3；并且加抗壞血酸的溶液的吸光度是隨著其加入量的增加而減少，即其清除作用是隨著抗壞血酸的加入量的增加而加強；而BHT的抗氧化性總體上是隨著BHT的加入量的增多而加強.比較圖1的三條曲線可以看出竹葉黃酮類物質(zhì)對DPPH自由基的清除效果明顯會比抗壞血酸的好，抗壞血酸對DPPH自由基的清除效果又會比BHT的清除效果來的好，即少量的竹葉黃酮類化合物便能對DPPH自由基的清除作用達到很好的效果，而抗壞血酸和BHT對DPPH自由基的清除作用相對沒有竹葉黃酮類物質(zhì)的好.并且抗壞血酸對DPPH自由基的清除作用是隨著加入量的增加而增大并且逐漸趨向于0.6；竹葉黃酮類物質(zhì)對DPPH自由基的清除作用則是在竹葉提取液加入量為0.2mL的時候便達到了74.73%，之后隨著其加入量的增加清除率緩慢上升，即竹葉黃酮類物質(zhì)的抗氧化效果會優(yōu)于抗壞血酸和BHT.

2.1.2 不同反應(yīng)時間竹葉提取液對DPPH自由基的清除效果的影響

由圖2可以看出竹葉提取液對DPPH自由基有很好的清除能力.當(dāng)竹葉的提取液加到0.2mL的時候竹葉黃酮類物質(zhì)對DPPH自由基的清除率達到了73.53%.由此可以看出竹葉黃酮類物質(zhì)對DPPH自由基的清除作用，只需要加入少量的提取液便可達到很好的抗氧化作用.隨著竹葉提取液的加入量的增加，其對DPPH自由基的清除作用增加，并逐漸趨向于1.

比較圖2和圖3同樣可以看出隨著竹葉提取液即竹葉黃酮類化合物的用量的增加，其對DPPH自由基的清除作用增加，并且放置15min后測定的清除率都稍高于即時測定的.

圖2 竹葉提取液用量對DPPH自由基的清除率（t=0min）

圖3 竹葉提取液用量對DPPH自由基的清除率（t=15min）

2.2 竹葉黃酮類物質(zhì)對羥基自由基的清除能力

由圖4可以看出隨著提取液加入量的增加其對羥基自由基的清除效果逐漸提升.由此可以證明竹葉黃酮類物質(zhì)具有良好的抗氧化性能.

圖4 竹葉提取液的用量對羥基自由基的清除率

2.3 竹葉黃酮類物質(zhì)對超氧陰離子自由基的清除能力

2.3.1 pH對黃酮類物質(zhì)清除超氧陰離子自由基的影響

由圖5-1可以看出加提取液的溶液的吸光度與未加提取液的溶液的吸光度都隨著反應(yīng)時間的增長，溶液的吸光度有微弱的上升.這表明溶液在中性的條件下只能使鄰苯三酚發(fā)生微弱的自氧化反應(yīng)產(chǎn)生有色的中間產(chǎn)物，使溶液的吸光度有微弱的上升.加提取液的溶液的吸光度會稍小于未加提取液，其部分原因是顏色中和的結(jié)果.

由圖5-2可以看出加提取液的溶液的吸光度的上升幅度比未加提取液的溶液的吸光度的上升的幅度小，但都有明顯的上升趨勢.這說明Tris-HCl的pH=8.15的時候，鄰苯三酚發(fā)生自氧化反應(yīng)，產(chǎn)生有色的中間產(chǎn)物使溶液的吸光度上升，加竹葉黃酮類物質(zhì)后，抗氧化劑和超氧陰離子很快的進行反應(yīng)，使吸光度減少.所以加提取液的溶液的吸光度會比未加提取液的溶液的吸光度低，加提取液的溶液的吸光度的上升趨勢會比未加提取液溶液的小.

由圖5-3可以看出在Tris-HCl的pH=9.19的時候，未加提取液的溶液的吸光度隨反應(yīng)時間的增長而增大，且在200s的時候趨于0.4，而加提取液的溶液的吸光度的上升幅度較小，且在90s的時候溶液的吸光度已經(jīng)接近0.15，清除速度過快，不適于實驗觀察.

由圖5-4可以看出未加提取的溶液的吸光度隨反應(yīng)時間的增長增大，且趨向于0.35，而未加提取液的溶液則是隨反應(yīng)時間的增長其吸光度緩緩沒有大的變化，其在60s的時候已接近對超氧陰離子的清除完全.這表明在Tris的pH=10.23的溶液也不適于實驗觀察.

圖5 不同pH值的竹葉提取液對超氧陰離子的清除率（A：pH=7.24；B：pH=8.15；C：pH=9.19；D：pH=10.23）

總之，由圖5可以得到在Tris-HCl的pH=8.15左右的時候是最適于實驗研究的.即與文獻查到的在Tris-HCl溶液的pH=8.20中進行實驗研究是相符的[10,11,12].

2.3.2 黃酮類物質(zhì)用量對清除超氧陰離子自由基的影響

由圖6可以看出隨著竹葉提取液的加入量的增加，竹葉黃酮類物質(zhì)對超氧陰離子的清除率是隨之增大的，其清除率從開始的快速上升到逐漸趨向于1.

圖6 竹葉提取液的用量對超氧陰離子的清除率（t=420s）

3 討論

本文研究竹葉黃酮類物質(zhì)的抗氧化性能是通過對DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基的清除作用來驗證的.

李安林等[13]研究結(jié)果表明對DPPH自由基的清除作用是隨著黃酮的用量成正比.王乃馨等[14]研究結(jié)果表明野馬追類黃酮的濃度與其對DPPH自由基清除活性間存在量效關(guān)系，并且野馬追類黃酮對DPPH自由基的清除效果大體的趨勢是：前5min較快，之后變緩，30-50min達平緩.王毅紅等[15]研究對比車前草黃酮類化合物與相同濃度下的VC和VE清除DPPH自由基的效果，結(jié)果表明黃酮類物質(zhì)的抗氧化性能會顯著高于相同濃度下的VC和VE.與本文研究結(jié)果是相一致的，即相同濃度下，竹葉黃酮類物質(zhì)的清除效果會優(yōu)于抗壞血酸和BHT；并且隨著提取液的濃度的增加其清除效果逐漸提升.

蔡為榮[16]的研究結(jié)果表明對羥基自由基的清除率與荷葉黃酮的用量存在量效關(guān)系.陸海峰等[17]的研究表明蒲公英的黃酮提取液對羥基自由基具有清除作用，其清除能力是隨著提取液的濃度的增加而增大的.

李利華[18]的研究結(jié)果表明在試驗的范圍內(nèi)，黃酮類化合物對羥基自由基、超氧陰離子自由基的清除作用與其用量呈正相關(guān).李穎暢等[19]的研究結(jié)果也表明清除作用與濃度間的關(guān)系，即隨著黃酮的用量的增加，黃酮對羥基自由基、超氧陰離子自由基的清除作用就越強.

潘娜[10]研究發(fā)現(xiàn)濃度為100mg·mL-1的竹葉黃酮對超氧陰離子的清除率為24%，當(dāng)濃度為l000 mg·mL-1時對超氧陰離子的清除率為94%；竹葉黃酮對羥基自由基的清除率為30.7%，對應(yīng)的濃度是5μg·mL-1，當(dāng)竹葉黃酮對羥基自由基的清除率為84.5%，對應(yīng)的竹葉黃酮的濃度是25μg·mL-1；對DPPH自由基的清除作用也是同樣的，即隨著濃度的增大，清除作用就越好.李鵬婧等[14]研究結(jié)果同樣驗證了黃酮用量與清除率之間的關(guān)系，即黃酮的濃度越大，抗氧化效果就越好.本實驗得出的結(jié)論是隨著竹葉提取液即竹葉黃酮類物質(zhì)的加入量的增加，竹葉黃酮類物質(zhì)對三者的清除作用是逐漸增強的，與文獻的結(jié)果是相符的.

4 結(jié)論

竹葉黃酮類物質(zhì)對DPPH自由基的清除效果隨竹葉提取液的加入量的增加而增大，且實驗具有良好的重現(xiàn)性.隨著反應(yīng)時間的增加，竹葉黃酮類物質(zhì)對DPPH自由基的清除效果就越佳.竹葉黃酮類物質(zhì)對DPPH自由基的清除效果顯著，其次是抗壞血酸對DPPH自由基的清除效果，再次是BHT，由此說明竹葉黃酮類物質(zhì)的抗氧化性能優(yōu)于抗壞血酸和BHT.

竹葉黃酮類物質(zhì)對羥基自由基的清除效果與竹葉提取液的加入量呈量效關(guān)系.由此也驗證了竹葉黃酮類物質(zhì)的抗氧化性能.

竹葉黃酮類物質(zhì)在Tris-HCl的pH=8.15的時候?qū)Τ蹶庪x子自由基有明顯的清除效果，與文獻一致.竹葉黃酮對超氧陰離子的清除作用隨反應(yīng)時間的增加其吸光度的變化逐漸減少，并且隨著竹葉提取液的加入量的增加，其對超氧陰離子的抑制作用增強.

〔1〕竹類綜合利用課題組.竹子研究匯刊[J].1991,10(1).

〔2〕唐莉莉,徐榕榕,丁霄霖.竹葉多糖對小鼠移植瘤的抑制作用 [J].無錫輕工大學(xué)學(xué)報,1998,17(3):62-65.

〔3〕張英.天然功能性添加劑-竹葉提取物[J].精細與專用化學(xué)品,2002(7):20-22.

〔4〕岳永德,操海群,湯鋒.竹提取物的化學(xué)成分及其利用研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2007,34(3):328-333.

〔5〕張英.竹葉黃酮的生理與藥理活性[J].世界竹藤通訊,2004,2(2):1211.

〔6〕許寶泉,吳水英,宋秋華.竹葉黃酮的生理功能研究進展[J].江西林業(yè)科技,2006(1):37-39.

〔7〕張英,吳曉琴,俞卓裕.竹葉和銀杏葉總黃酮含量及其抗自由基活性的比較研究[J].中國中藥雜志,2002,27(4):254-257.

〔8〕陶文亮,吳鈺娟.竹葉黃酮提取分析方法的研究及其新進展[J].貴州化工,2009,34(3):15-18.

〔9〕陳宇,鄧金木,林麗麗,等.竹葉總黃酮提取工藝研究[J].莆田學(xué)院學(xué)報,2012,19(2):38-41.

〔10〕潘娜.竹葉黃酮的抗氧化性及對油炸薯條中丙烯酰胺抑制作用的研究 [D].北京林業(yè)大學(xué),2010.

〔11〕羅宇倩,郭輝,胡林福,等.竹葉黃酮的抗氧化活性研究[J].食品科技,2011,36(7):201-203.

〔12〕李鵬婧,柳旭光,龍海榮,等.超聲波輔助提取菱角殼總黃酮及抗氧化性研究 [J].食品科技，2011,36(1):167-171.

〔13〕李安林,熊雙麗.接骨木莖總黃酮的提取及DPPH自由基清除活性[J].中國食品添加劑,2010(5):113-116.

〔14〕王乃馨,王衛(wèi)東,鄭義,等.野馬追類黃酮清除DPPH自由基活性研究 [J].中國食品添加劑，2010(6):84-87.

〔15〕王毅紅,方玉梅,譚萍,等.車前草黃酮類化合物清除DPPH自由基的作用[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010,38(8):50-52.

〔16〕蔡為榮.微波提取荷葉黃酮及其清除羥基自由基的研究[J].食品科學(xué),2004,25(9):112-115.

〔17〕陸海峰,羅建華,蒙春越,等.蒲公英總黃酮提取及對羥自由基清除作用 [J].廣州化工,2009,37(3):101-103.

〔18〕李利華.柑橘皮中總黃酮的含量測定及體外自由基清除作用研究 [J].西北藥學(xué)雜志,2009,24(5):361-363.

〔19〕李穎暢,吳笳笛,孫建華,等.化學(xué)發(fā)光法測定藍莓葉黃酮提取物對氧自由基的清除作用[J].中國調(diào)味品,2009,34(12):102-105.