超聲波輔助提取分離菠菜色素的工藝研究

黃飛，屈飛強(qiáng)，任曉瓊

（黃山學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，黃山 245041）

菠菜又稱為赤根菜、鸚鵡菜和波斯草，含有豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素A、B、C、磷、鐵和鈣等營(yíng)養(yǎng)素物質(zhì)[1]，還含有葉綠素、胡蘿卜素和葉黃素等多種天然色素[2]，對(duì)人體具有較好的生理學(xué)作用。葉綠素是植物進(jìn)行光合作用所必需的催化劑，主要以葉綠素a 和葉綠素b 兩種形式存在，葉綠素及其鈉鹽具有殺菌、除臭、解熱、止血等功能，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥衛(wèi)生和日用化學(xué)工業(yè)[3]。胡蘿卜素具有三種異構(gòu)體，其中β-胡蘿卜素除具有維生素A 的生理活性外，還具有抗氧化作用，清除體內(nèi)自由基，提高人體免疫力，延緩細(xì)胞和機(jī)體的衰老，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品及飼料添加劑等方面[4]。葉黃素是一種類胡蘿卜素，是天然的食品色素和食品營(yíng)養(yǎng)劑，具有抗氧化、抗衰老和抗突變等生物活性[5]。我國(guó)菠菜資源豐富，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，具有較大的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。采用超聲波輔助提取方法[6-11]對(duì)菠菜色素進(jìn)行提取，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)研究了提取劑、料液比、提取溫度、超聲波功率和超聲波時(shí)間對(duì)提取效果的影響，并利用柱層析法對(duì)菠菜色素進(jìn)行分離。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器

KQ-400KDE 型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；UV-2100 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；電子分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；層析柱（30×2 cm）。

1.2 原料和試劑

市售菠菜；95%乙醇，無(wú)水乙醇，丙酮，氫氧化鈉，石油醚（60～90 ℃）等均為分析純；柱層析使用200～300 目柱層析硅膠（青島海洋化工廠生產(chǎn)）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

準(zhǔn)確稱取一定量新鮮干凈切碎的菠菜葉，置入潔凈干燥的錐形瓶中，在錐形瓶中加入一定量和一定濃度的提取劑，使之混合均勻后，把錐形瓶置于超聲波清洗器的浴槽中，一定溫度下進(jìn)行超聲波震蕩提取一定時(shí)間。用循環(huán)水式真空泵將超聲震蕩后混合溶液進(jìn)行固液分離，收集提取液，取0.5 mL 提取液用提取劑稀釋定容到25 mL，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)其λmax=430 nm 處吸光度A，根據(jù)下列公式計(jì)算菠菜色素的產(chǎn)率[12]。

C（mg·mL-1）=菠菜色素吸光度A430/吸收系數(shù)

菠菜色素的產(chǎn)率= [C（mg·mL-1）×提取液總量（mL）]/ 樣品鮮重（g）

將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，根據(jù)胡蘿卜素、葉黃素、葉綠素極性不同，用柱層析法分離菠菜色素。向?qū)游鲋鶅?nèi)加入高度為1～2 cm、體積比為10∶1的石油醚-丙酮混合液作為洗脫劑，打開(kāi)玻璃閥讓洗脫劑逐滴流出，當(dāng)?shù)? 個(gè)有色成分滴出時(shí)，取一潔凈錐形瓶收集，得橙黃色溶液為β-胡蘿卜素。將體積比為5∶1 的石油醚-丙酮混合液作為洗脫劑，繼續(xù)洗脫可得到第2 個(gè)色帶的棕黃色溶液為葉黃素。再將體積比為2∶1 的石油醚-丙酮混合液作為洗脫劑，可以依次得到葉綠素a（藍(lán)綠色）和葉綠素b（黃綠色）[13-15]，最終實(shí)現(xiàn)β-胡蘿卜素、葉黃素、葉綠素a 和葉綠素b 的分離。

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

3.1.1 提取劑對(duì)提取菠菜色素的影響

稱取3.0 g 新鮮干凈的菠菜葉分別置于30 mL的水、0.1%NaOH、5%NaOH、丙酮、95%乙醇、混合液A（乙醇：石油醚=3∶2，體積比）、混合液B（乙醇：丙酮=1∶1，體積比）中，在室溫條件下，用超聲波清洗器處理30 min。取0.5 mL 提取液，用95%乙醇稀釋定容到25 mL，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)其λmax=430 nm 處吸光度A，計(jì)算菠菜色素的產(chǎn)率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1 所示。

表1 不同提取劑對(duì)提取效果的影響Table 1 Effects of different extracting reagent on extraction result

由表1 可知，不同的提取劑其提取效果差異較大，混合液要比單一溶劑的提取效果好，混合液從菠菜葉片中直接提取色素效率明顯提高，這是一種協(xié)萃現(xiàn)象[16]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇混合液B（乙醇：丙酮=1∶1，體積比）為提取劑時(shí)，提取液的吸光度最大，菠菜色素的產(chǎn)率最高，因此選擇混合液B 為提取劑效果較好。

3.1.2 料液比對(duì)提取菠菜色素的影響

稱取3.0 g 新鮮干凈的菠菜葉于錐形瓶中，分別加入9、12 、15 、18、21 mL 的混合液B（乙醇：丙酮=1∶1，體積比），在室溫條件下，用超聲波清洗器處理30 min。取提取液0.5 mL，用混合液B 稀釋定容到25 mL，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)其λmax=430 nm 處吸光度A，計(jì)算菠菜色素的產(chǎn)率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2 所示。

表2 液料比對(duì)提取效果的影響Table 2 Effects of the ratio of material to fluid on extraction result

由表2 可知，不同的料液比對(duì)提取效果有明顯 的影響。在提取過(guò)程中，當(dāng)包容固體的溶液的溶質(zhì)濃度和浸出液溶質(zhì)濃度相等時(shí)，提取達(dá)到平衡[3]。當(dāng)料液比較小時(shí)，菠菜色素浸出液的吸光度較小，產(chǎn)率較低，當(dāng)料液比為1∶5 時(shí)，吸光度達(dá)到最大，菠菜色素的產(chǎn)率最高。隨料液比的增加，菠菜色素的產(chǎn)率反而減小，因此選擇料液比為1∶5 時(shí)提取效果較好。

3.1.3 提取溫度對(duì)提取菠菜色素的影響

稱取3.0 g 新鮮干凈菠菜葉于錐形瓶中，加入15 mL 混合液B（乙醇：丙酮=1∶1，體積比），保持料液比為1∶5（g·mL-1），分別在30 ℃，40 ℃，50 ℃，60 ℃，70 ℃下，用超聲波清洗器處理30 min 后，取提取液0.5 mL，用混合液B 稀釋定容到25 mL，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)其λmax=430 nm 處吸光度A，計(jì)算菠菜色素的產(chǎn)率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3 所示。

表3 提取溫度對(duì)提取效果的影響Table 3 Effects of extraction temperature on extraction result

由表3 可知，不同的提取溫度對(duì)提取效果有明顯的影響。當(dāng)提取溫度較低時(shí)，菠菜色素浸出液的吸光度較小，產(chǎn)率較低，當(dāng)提取溫度為50℃時(shí)，吸光度達(dá)到最大，菠菜色素產(chǎn)率最高。隨提取溫度的增加，菠菜色素的產(chǎn)率反而減小。這是因?yàn)樵谔崛∵^(guò)程中，隨著提取溫度的增加，菠菜色素分子擴(kuò)散速度加快，提取劑能更好地溶進(jìn)其分子中，使其提取效果更好，菠菜色素浸出液的吸光度增加，產(chǎn)率也增加；當(dāng)提取溫度達(dá)到一定時(shí)，提取劑在菠菜色素分子中達(dá)到飽和，不能繼續(xù)溶進(jìn)其分子中，菠菜色素浸出液吸光度減小，產(chǎn)率降低，因此選擇提取溫度為50 ℃提取效果較好。

3.1.4 超聲波時(shí)間對(duì)提取菠菜色素的影響

稱取3.0 g 新鮮干凈菠菜葉于錐形瓶中，加入15 mL 混合液B（乙醇：丙酮=1∶1，體積比），保持料液比為1∶5（g·mL-1），溫度為50 ℃，用超聲波清洗器分別處理15、30、45、60、75 min。取提取液0.5 mL，用混合液B 稀釋定容到25 mL，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)其λmax=430 nm 處吸光度A，計(jì)算菠菜色素的產(chǎn)率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4 所示。

表4 超聲波時(shí)間對(duì)提取效果的影響Table 4 Effects of ultrasonic extraction time on extraction result

由表4 可知，隨著超聲波時(shí)間的增加，菠菜色素浸出液吸光度逐漸增加，產(chǎn)率也逐漸升高，當(dāng)超聲波時(shí)間為60 min 時(shí)，菠菜色素浸出液吸光度減小，產(chǎn)率降低。其原因可能是在超聲波輻射的過(guò)程中，超聲波能量直接傳遞到菠菜葉的內(nèi)部，使之瞬時(shí)加熱，溫度急劇上升。超聲輻射時(shí)間越長(zhǎng)，溫度越高，而菠菜色素對(duì)熱的穩(wěn)定性不好，所以導(dǎo)致菠菜色素的吸光度減小[3]，產(chǎn)率降低。因此選擇超聲波時(shí)間為60 min 提取效果較好。

3.1.5 超聲波功率對(duì)提取菠菜色素的影響

稱取3.0 g 新鮮干凈菠菜葉于錐形瓶中，加入15 mL 混合液B（乙醇：丙酮=1∶1，體積比），保持料液比為1∶5（g·mL-1），溫度為50 ℃，用超聲波清洗器經(jīng)過(guò)功率分別為120 W、160 W、200 W、240 W、280 W的超聲波處理60 min 后，取提取液0.5 mL，用混合液B 稀釋定容到25 mL，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)其λmax=430 nm 處吸光度A，計(jì)算菠菜色素的產(chǎn)率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5 所示。

表5 超聲波功率對(duì)提取效果的影響Table 5 Effects of ultrasonic power on extraction result

由表5 可知，隨著超聲波功率的增加，菠菜色素 浸出液吸光度不斷增加，產(chǎn)率逐漸升高。當(dāng)超聲波功率為240 W 時(shí)，菠菜色素浸出液吸光度達(dá)到最大，菠菜色素的產(chǎn)率最高。隨著超聲波功率的繼續(xù)增加，吸光度反而減小，產(chǎn)率降低。這是因?yàn)殡S著超聲功率的增加，超聲的空化作用、機(jī)械剪切的攪拌作用隨之加強(qiáng)，菠菜細(xì)胞充分破裂[8]。當(dāng)超聲波功率過(guò)大時(shí)，可能會(huì)引起局部溶液瞬時(shí)升溫過(guò)熱，對(duì)菠菜色素的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，使菠菜色素的構(gòu)象發(fā)生改變[6]，從而影響菠菜色素的提取效果。

3.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

3.2.1 正交試驗(yàn)影響因素的選擇

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提取劑、料液比、提取溫度、超聲波提取時(shí)間和超聲波功率均會(huì)影響菠菜色素的提取，因此選取這五個(gè)因素同時(shí)作為考察因素，其實(shí)驗(yàn)的影響因素和水平見(jiàn)表6。

表6 正交試驗(yàn)因素和水平表Table 6 Factor-level of orthogonal experiment

3.2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

為了提高菠菜色素的產(chǎn)率，考察各實(shí)驗(yàn)因素對(duì)提取菠菜色素的影響，進(jìn)行了5 因素4 水平L16（45）正交試驗(yàn)。其正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 L16（45）正交試驗(yàn)表及結(jié)果Table 7 Results of orthogonal experimen L16（45）

表7 中的R 為各因素的極差值，極差值的大小反映了實(shí)驗(yàn)因素對(duì)提取菠菜色素產(chǎn)率的影響。由極差分析結(jié)果可以看出，以提取菠菜色素產(chǎn)率為考察指標(biāo)，5 種因素對(duì)提取菠菜色素產(chǎn)率的影響程度大小順序依次為：提取劑（A）＞料液比（B）＞提取溫度（C）＞超聲波功率（E）＞超聲波時(shí)間（D）；因此菠菜色素的最佳提取條件為：A4B2C3E4D1，即以乙醇與丙酮混合液（體積比為1∶1）為提取劑，料液比為1∶5（g·mL-1），提取溫度為50 ℃，超聲波時(shí)間為30 min，超聲波功率為280 W，菠菜色素的提取效果最好，其產(chǎn)率為0.187 mg·g-1。

4 結(jié)論

（1）利用超聲波輔助法提取菠菜中的色素，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)考察了提取劑、料液比、提取溫度、超聲波時(shí)間和超聲波功率對(duì)提取效果的影響，得到了提取菠菜色素工藝的最優(yōu)條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以乙醇與丙酮混合液（體積比為1∶1）為提取劑，料液比為1∶5（g·mL-1），提取溫度為50 ℃，超聲波時(shí)間為30 min，超聲波功率為280 W，菠菜色素的提取效果最好，其產(chǎn)率為0.187 mg·g-1。超聲波輔助提取法具有提取速度快、產(chǎn)率高、節(jié)約能源、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，在天然色素的提取中具有廣闊的應(yīng)用前景。

（2）根據(jù)胡蘿卜素、葉黃素、葉綠素極性不同，以不同體積比的石油醚-丙酮混合液作為洗脫劑，用層析柱法分離了菠菜色素，既能達(dá)到很好的分離效果，又能循環(huán)利用溶劑。

［1］舒友琴，梁麗琴，扶慶權(quán)，等.菠菜葉蛋白的提取研究［J］.食品科學(xué)，2005，26（10）：124-217.

［2］翟虎，陳小全，孫兆國(guó)，等.菠菜色素提取方法的改進(jìn)及穩(wěn)定性研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34（2）：157-159.

［3］陳正，劉常坤.超聲波萃取菠菜葉中葉綠素的研究［J］.化學(xué)與生物工程，2004（6）：37-38.

［4］朱秀靈，車振明，徐偉，等.β-胡蘿卜素生理功能及提取技術(shù)的研究進(jìn)展［J］.西華大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2005，24（1）：71-76.

［5］Wang M C，Rong T，Zhang S F，et al.Antioxidant activity，mutagenicity/ anti-mutagenicity，and clastogenicity/ anticlastogenicity of lutein from marigold flowers ［J］.Food Chem Toxicol，2006，44（9）：1522-1529.

［6］謝宏，尹梅，劉鏡，等.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取紅米色素的工藝研究［J］.食品工業(yè)科技，2014，35（3）：271-274.

［7］劉亞敏，劉玉民，李瓊，等.超聲波輔助提取山銀花綠原酸工藝及其抗氧化性研究［J］.食品工業(yè)科技，2014，35（1）：186-190.

［8］曹楠楠，陳香榮，吳艷.苦豆子多糖的超聲波提取工藝優(yōu)化及理化性質(zhì)研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2014，30（2）：209-215.

［9］廖芙蓉，闞建全，熊麗娜.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取籽粒莧花穗色素工藝［J］.食品科學(xué)，2013，34（2）：93-98.

［10］孫海濤，邵信儒.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取山核桃殼色素工藝［J］.東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，40（2）：74-77.

［11］孫天宇，楊宏志.超聲波法提取沙棘葉總黃酮最佳工藝的研究［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，24（3）：45-50.

［12］張志良，翟偉晶.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］.北京：北京高等教育出版社，2003.

［13］李東穎，李曉霞，趙喜芝.綠色植物色素的提取及理化性質(zhì)的研究［J］.化學(xué)工程師，2005（11）：63-64.

［14］杜莉萍，商金玲，王大明，等.薄層色譜法分離菠菜色素及胡蘿卜素含量測(cè)定［J］.分子科學(xué)學(xué)報(bào)，2013，29（1）：84-88.

［15］李玉明，林琳，陳堅(jiān)剛，等.薄層色譜法在葉綠體色素分離實(shí)驗(yàn)中的有效應(yīng)用［J］.生物學(xué)通報(bào)，2005，40（12）：53-54.

［16］洪法水，魏正貴，趙貴文.菠菜葉綠素的浸提和協(xié)同萃取反應(yīng)［J］.應(yīng)用化學(xué)，2001，18（7）：532-535.