解淀粉芽孢桿菌中性蛋白酶基因的克隆與表達(dá)

杜珊珊，王穎，張東杰

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319）

中性蛋白酶是一類在中性pH 條件下作用于蛋白質(zhì)肽鍵的蛋白酶[1]，其能將大分子蛋白質(zhì)迅速水解成肽類和部分游離氨基酸[2]，具有廣泛的市場價值，被應(yīng)用于紡織、醫(yī)療、皮革、食品等行業(yè)[3-4]，但中性蛋白酶產(chǎn)量低，成本高，發(fā)酵不穩(wěn)定等，為了提高酶活性，世界各國科研工作者主要在蛋白酶基因的篩選，基因序列[5-6]，克隆表達(dá)[7]等方面進(jìn)行研究。比如楊慶云等[8]用鳥槍法克隆得到嗜熱脂肪芽孢桿菌的中性蛋白酶基因，該基因表達(dá)量提高了約30 倍。茆軍等[9]成功克隆了高溫中性蛋白酶基因，并在畢赤酵母中正確表達(dá)。

此前對中性蛋白酶的研究主要集中在蠟狀芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌，而對解淀粉芽孢桿菌中性蛋白酶的研究相對較少。解淀粉芽孢桿菌是一種革蘭氏陽性細(xì)菌，與枯草芽孢桿菌具有很近的親緣關(guān)系[10-11]，它具有較強的胞外酶分泌能力，是淀粉酶、蛋白酶的一些主要酶制劑的生產(chǎn)菌株[12]。研究以中性蛋白酶生產(chǎn)菌株解淀粉芽孢桿菌為研究對象，利用基因工程技術(shù)對其中性蛋白酶基因進(jìn)行了克隆表達(dá)，獲得了具有一定活性的中性蛋白酶。

1 材料與方法

1.1 材料

解淀粉芽孢桿菌購自中國工業(yè)菌種保藏管理中心，E.coli BL21（DE3）與質(zhì)粒PET-28a 由實驗室保存，Taq DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、SalⅠ、T4-DNA 連接酶購于大連TaKaRa 產(chǎn)品，IPTG（異丙基-β-D 硫代半乳糖苷）、DNA 提取試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA 小提中量試劑盒購自北京博大泰克生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制

蛋白胨2.5 g、牛肉膏5 g、酵母膏2.5 g、葡萄糖2.5 g、氯化鈉2.5 g、瓊脂5 g、蒸餾水500 mL、pH7.0。將菌種放入培養(yǎng)基，在30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d[13]。

1.2.2 解淀粉芽孢桿菌總DNA 的提取

以解淀粉芽孢桿菌為材料，采用細(xì)菌基因組DNA 快速提取試劑盒，提取菌株的總DNA，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA 的含量，在-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 解淀粉芽孢桿菌中性蛋白酶基因的克隆

根據(jù)Gene Bank 中報道的解淀粉芽孢桿菌中性蛋白酶基因序列（登錄號為：M36723.1），借助OLIGO 生物學(xué)軟件設(shè)計，并在正反向引物中添加BamHⅠ和SalⅠ酶切位點，序列如下：

正向引物：CGCGGATCCGTGGGTTTAGGTAAG AAATTG

反向引物：GCGTCGACTTACAATCCGACTGCAT TCC

通過PCR 技術(shù)擴(kuò)增中性蛋白酶基因，反應(yīng)體系50 μL，擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃，變性40 s，50 ℃退火40 s，72 ℃延伸1.5 min，35 個循環(huán)；72 ℃后再延伸10 min。將PCR 產(chǎn)物回收純化后與PMD18-T Vector 進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，并涂布在Amp、X-Gal、IPTG 的固體培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)12～15 h 后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌落放進(jìn)含氨芐的LB 液體培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)，送到上海生工公司進(jìn)行測序，將其正確的重組質(zhì)粒命名為PMD18-T-npr，并進(jìn)行同源性比較。

1.2.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將經(jīng)鑒定正確的重組質(zhì)粒PMD18-T-npr 和PET-28a 分別用BamHⅠ和SalⅠ進(jìn)行雙酶切，采用試劑盒回收純化。將純化后的目的片段和PET-28a置于10 μL 反應(yīng)體系中進(jìn)行連接，16 ℃連接12 h，過夜培養(yǎng)，隨后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)到E.coli BL21（DE3）中，把平板上的白斑轉(zhuǎn)化子用PCR 和雙酶切進(jìn)行鑒定。

1.2.5 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)

將構(gòu)建成功的BL21/PET-npr 工程菌株接種于5 mL 含卡納抗性的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，按1%的接種量轉(zhuǎn)接于新液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8 h，此時加入IPTG（終濃度為1.0 mmol·L-1），37 ℃誘導(dǎo)4 h，以未誘導(dǎo)菌為對照。取適量的菌液在4 ℃8 000 r·min-1離心10 min，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE 分析，具體方法參照文獻(xiàn)[14]。

IPTG 是一種作用極強的誘導(dǎo)劑，能夠啟動E.coli BL21（DE3）中l(wèi)ac 啟動子的轉(zhuǎn)錄，但并不是IPTG 添加的越多就越好。

（1）按照上述的方法，選取不同IPTG 濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L-1）進(jìn)行誘導(dǎo)，在37 ℃保溫2 h 后，測得酶活力進(jìn)行分析。

（2）確定最佳的誘導(dǎo)溫度，試驗以IPTG 濃度為0.8 mmol·L-1，在不同溫度條件下（20 ℃、25 ℃、30℃、35 ℃、40 ℃）誘導(dǎo)2 h 后，對酶活力的影響。

（3）考察不同的誘導(dǎo)時間（1、2、3、4、5 h），其他條件固定不變（IPTG 濃度為0.8 mmol·L-1，溫度在30 ℃）進(jìn)行誘導(dǎo)，確定最佳誘導(dǎo)條件。

1.2.6 蛋白酶活力的測定

按照標(biāo)準(zhǔn)GBT 23527-2009，將1 mL 酶液與1%酪蛋白1 mL 混合，在pH 7.5，40 ℃條件下，每分鐘反應(yīng)產(chǎn)生1 μg 酪氨酸所需要的酶量為1 個酶活力單位（U）[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 擴(kuò)增獲得目的片段

根據(jù)所設(shè)計的引物，以解淀粉芽孢桿菌染色體DNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。電泳檢測反應(yīng)結(jié)果如圖1。在1 566 bp 處可見一條與預(yù)期大小相符的特異性條帶。

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

將PCR 產(chǎn)物和質(zhì)粒PET-28a 分別用BamHⅠ和SalⅠ進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，用T4DNA連接酶16 ℃過夜連接，將其轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組質(zhì)粒PET-28a/npr，挑取陽性克隆并提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗證，如圖2 所示，得到一條約5 369 bp與質(zhì)粒PET-28a 大小相符，和另一條1 566 bp 與目的片段大小相符，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 Bacillus amyloliquefaciens 中性蛋白酶基因擴(kuò)增電泳圖Fig.1 PCR product of npr gene in the Bacillus amyloliquefaciens

圖2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.2 Enzyme identification of recombinant plasmid

2.3 目的片段的測序結(jié)果

將上述重組質(zhì)粒發(fā)送到上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序。得到的基因全長為1 566 bp，編碼一個由522 個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，通過BLAST軟件對中性蛋白酶核苷酸序列進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)測序結(jié)果與Genebank（登錄號：M36723.1）中解淀粉芽孢桿菌中性蛋白酶基因序列具有100%同源性。證明重組質(zhì)粒PET-28a/npr 構(gòu)建成功。

2.4 SDS-PAGE 檢測結(jié)果

將鑒定過的陽性菌轉(zhuǎn)入含有卡納抗性的大腸桿菌中，按照試驗方法對重組子進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集上清液，根據(jù)SDS-PAGE 進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3，經(jīng)過誘導(dǎo)的重組子PET-28a/npr 出現(xiàn)一條明顯特異性蛋白條帶，分子質(zhì)量約為57 kDa，該條帶大小與基因序列推導(dǎo)的蛋白大小相符，而未經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)的重組蛋白和經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)的空載體則都未出現(xiàn)此條帶，此說明解淀粉芽孢桿菌中性蛋白酶在大腸桿菌中得到了成功的表達(dá)。

圖3 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE 鑒定結(jié)果Fig.3 Identification of the expression product by SDS-PAGE

2.5 IPTG 誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

2.5.1 最佳誘導(dǎo)濃度的確定

如圖4 所示，隨著誘導(dǎo)濃度的增大，中性蛋白酶活力逐漸上升，在IPTG 濃度為0.8 mmol·L-1時酶活力達(dá)到最大，繼續(xù)加大誘導(dǎo)濃度，酶活力反而不高。

圖4 IPTG 濃度中性蛋白酶酶活力的影響Fig.4 Effects of concentration of IPTG on neutral protease enzyme activity

2.5.2 最佳誘導(dǎo)溫度的確定

溫度決定蛋白可溶性的一個重要因素，誘導(dǎo)溫度過高容易以包涵體形式存在，溫度過低酶活力降低，結(jié)果如圖5 所知，隨著溫度的升高，在30 ℃時酶活力達(dá)到最大值，繼續(xù)加熱不利于酶活力。

圖5 溫度對中性蛋白酶酶活力的影響Fig.5 Effects of temperature on the neutral protease enzyme activity

2.5.3 最佳誘導(dǎo)時間的確定

如圖6 所見，誘導(dǎo)1 h 后融合蛋白就有一定量的表達(dá)，隨著誘導(dǎo)時間的增長，中性蛋白酶酶活力緩慢升高，誘導(dǎo)時間在4 h 時，酶活力達(dá)到最大，而繼續(xù)誘導(dǎo)酶活力并沒有提高，因此最佳誘導(dǎo)時間為4 h。

圖6 誘導(dǎo)時間對中性蛋白酶酶活力的影響Fig.6 Effects of induction time on the neutral protease enzyme activity

2.6 表達(dá)蛋白的酶活性測定

將重組菌按照上述最佳IPTG 誘導(dǎo)條件進(jìn)行培養(yǎng)，裂解細(xì)胞離心取上清液，檢測其蛋白酶活性，并做空白對照試驗，結(jié)果顯示重組大腸桿菌陽性菌的表達(dá)產(chǎn)物最高酶活力達(dá)到450 U·mL-1。

3 討論

中性蛋白酶的研究開發(fā)工作在上世紀(jì)70年代就已開始，國外最早開展基因克隆表達(dá)的有關(guān)工作，1953年Fuji[16]等從嗜熱脂肪芽孢桿菌CU21 中成功克隆了中性蛋白酶基因，并將其轉(zhuǎn)入另一菌株（MD-3）中進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)酶量比供體菌高出15 倍。除此之外，有地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌等在內(nèi)的10 余種芽孢桿菌來源的蛋白酶基因得到了克隆表達(dá)。目前，商業(yè)上所用的中性蛋白酶大部分來源于芽孢桿菌屬，中性蛋白酶在商品酶中占有較大的份額。因此，利用基因克隆技術(shù)提高中性蛋白酶的產(chǎn)量，并對其性能進(jìn)行改性，為中性蛋白酶的應(yīng)用具有較好的發(fā)展前景。

試驗采用分子生物學(xué)方法，用PCR 擴(kuò)增得到中性蛋白酶，利用表達(dá)載體PET-28a 在大腸桿菌中高效的表達(dá)。并采用SDS-PAGE 電泳進(jìn)行分析，對誘導(dǎo)濃度、時間和溫度進(jìn)行優(yōu)化，最高酶活性達(dá)到450 U·mL-1，在今后的試驗中還將進(jìn)一步分離純化，獲得的純酶用于重組中性蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)及其應(yīng)用的研究，這將最大化提高中性蛋白酶的產(chǎn)量和活性，為工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用具有重要的意義。

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