脂肪酶的固定化及其性能研究

程娟，鹿保鑫，王霞，易偉民

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319）

脂肪酶是一類特殊的酯鍵水解酶[1]，能催化油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯。此外，還可以用于生物表面活性劑的合成、多肽合成、聚合物的合成和藥物的合成等[2]。而固定化脂肪酶是將脂肪酶通過(guò)物理或化學(xué)的方法制備成為不溶于水的，但仍具有催化活性的復(fù)合體，這一過(guò)程是將單體的游離脂肪酶轉(zhuǎn)變成了復(fù)合脂肪酶催化劑[3-4]。將脂肪酶進(jìn)行固定化，可以提高酶的專一性以及穩(wěn)定性等，使酶的性質(zhì)更加穩(wěn)定，且反應(yīng)條件溫和，副產(chǎn)物少，易于分離[5]。目前固定化脂肪酶的制備上還存在一些限制因素[6-7]，例如，在固定化上載體的設(shè)計(jì)上、在制備和選用上，固定化脂肪酶的方法等方面[8]。

在特異性上脂肪酶的區(qū)分不是很明顯，根據(jù)反應(yīng)條件的不同，其特異性也有差異[9]，所以，試驗(yàn)以兩種不同的脂肪酶為原料，分別進(jìn)行固定化，考察了硅烷化試劑添加量、硅藻土與酶的質(zhì)量比、溫度、時(shí)間等四個(gè)因素對(duì)酶的固定化的影響，并對(duì)影響因素進(jìn)行了單因素試驗(yàn)，確定了最佳的工藝參數(shù)，希望為實(shí)際生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)上的支持。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

脂肪酶（Lipase）：Sigma 公司生產(chǎn)；乙烯基三甲氧基硅烷，南京化學(xué)試劑有限公司；鹽酸，南京化學(xué)試劑有限公司；過(guò)氧化氫，南京化學(xué)試劑有限公司；甲苯，南京化學(xué)試劑有限公司；乙醇，南京化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器

DK-S24 電熱恒溫水浴鍋，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；AR2140 電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；RE52-98 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SHY-2 恒溫水域振蕩器，江蘇金壇環(huán)宇科學(xué)儀器廠；JJ-1 精密定時(shí)電動(dòng)攪拌器，江蘇金壇榮華儀器制造有限公司；LD4-40 低速大容量離心機(jī)，北京京立離心機(jī)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 羥基化處理

準(zhǔn)確稱取20 g 硅藻土顆粒，將其放在容量為250 mL 的圓底燒瓶中，分別向其中加入1 mol·L-1的HCl 35 mL，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的H2O2溶液35 mL，最后加入175 mL 的去離子水，充分混勻，然后用攪拌槳在80 ℃水浴鍋條件下攪拌5 min 后，停止攪拌靜置分層，將上層混合液倒掉，反復(fù)用去離子水洗滌至少5 次，取出硅藻土，放置在平皿上，放置在70 ℃的恒溫干燥箱中干燥。

1.3.2 硅烷化處理

稱取10 g 經(jīng)過(guò)羥基化處理后的硅藻土放置在容量為100 mL 的圓底燒瓶中，依次向其中加入少量硅烷化試劑和40 mL 甲苯充分混勻，用攪拌槳于室溫條件下攪拌1 h，待反應(yīng)結(jié)束后，靜置分層，倒掉上層混合液，用甲苯和乙醇的混合液充分洗滌硅藻土3次以上，取出硅藻土，放置在平皿中室溫干燥即可得到經(jīng)硅烷化處理后的硅藻土。

1.3.3 脂肪酶的固定和活力測(cè)定

在4 mL pH 7.0，0.03 mol·L-1的tris-HCl 緩沖溶液中加入0.02 g 脂肪酶，分裝在離心管中，離心條件為8 000 r·min-1離心10 min，用移液槍分別稱取上清液于50 mL 燒杯中，將一定質(zhì)量的經(jīng)過(guò)處理后硅藻土載體加入到酶液中，將瓶口密封，將其放在一定溫度的搖床中緩慢震蕩一定時(shí)間后取出，過(guò)濾燒杯中的混合物，用同樣的緩沖液沖洗固體數(shù)次，最后將其取出，放置在平皿上，干燥。這時(shí)所得的即為吸附固定化酶。而酶的活力測(cè)定參照國(guó)標(biāo)GB/T5523-2008測(cè)定。

1.3.4 硅烷化試劑添加量對(duì)固定脂肪酶活力的影響

硅烷化添加量分別調(diào)為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6%，硅藻土與酶的質(zhì)量比為4∶1，固定溫度為30 ℃，固定時(shí)間為6 h。在此條件下，檢驗(yàn)硅烷化試劑對(duì)固定化脂肪酶活力的影響。

1.3.5 硅藻土與酶質(zhì)量比對(duì)固定脂肪酶活力的影響

硅藻土與酶的質(zhì)量比分別調(diào)為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1 和6∶1，硅烷化試劑添加量為0.3%，固定溫度為30 ℃，固定時(shí)間為6 h。在此條件下，檢驗(yàn)硅藻土與酶質(zhì)量比對(duì)固定脂肪酶活力的影響。

1.3.6 固定溫度對(duì)固定脂肪酶活力的影響

溫度分別設(shè)置為22、24、26、28、30、32 ℃，硅藻土與酶的質(zhì)量比為4∶1，硅烷化試劑添加量為0.3%，固定時(shí)間為6 h。在此條件下，檢驗(yàn)固定溫度對(duì)固定化脂肪酶活力的影響。

1.3.7 固定時(shí)間對(duì)固定脂肪酶活力的影響

固定時(shí)間分別設(shè)置為3、4、5、6、7 、8 h，硅烷化試劑添加量為0.3%，硅藻土與酶的質(zhì)量比為4∶1，固定溫度為30 ℃。在此條件下，檢驗(yàn)固定時(shí)間對(duì)固定脂肪酶活力的影響。

1.3.8 響應(yīng)面法優(yōu)化固定酶的最佳條件

通過(guò)單因素試驗(yàn)確定各因素的范圍，以固定脂肪酶酶活性為響應(yīng)值進(jìn)行四元二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，并采用Design-Expert.V8.0.6 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到最佳的固定化條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 硅烷化試劑添加量對(duì)固定脂肪酶活力的影響

由圖1 可知固定脂肪酶活力隨著硅烷化試劑添加量先升高后降低，在硅烷化試劑添加量為0.4%達(dá)到最大值，硅烷化試劑添加量過(guò)高導(dǎo)致固定脂肪酶活力降低是因?yàn)榕悸?lián)劑過(guò)多使游離的化學(xué)鍵過(guò)多，起不到固定作用。

圖1 硅烷化試劑添加量對(duì)固定脂肪酶活力的影響Fig.1 Impacts of additive amount of silicon alkylation reagents to the immobilized lipase activity

2.1.2 硅藻土與酶質(zhì)量比對(duì)固定脂肪酶活力的影響

由圖2 可知硅藻土與酶的質(zhì)量比越大，固定脂肪酶活力也就越低，應(yīng)為固定的脂肪酶與大量的硅烷化處理后的硅藻土結(jié)合，酶的活力就相對(duì)降低了。

圖2 硅藻土與酶質(zhì)量比對(duì)固定脂肪酶活力的影響Fig.2 Impacts of the quality proportion between diatomaceous earth and enzyme to the immobilized lipase activity

2.1.3 固定溫度對(duì)固定脂肪酶活力的影響

由圖3 可知隨著溫度的升高固定脂肪酶的活力開(kāi)始升高，當(dāng)溫度達(dá)到30 ℃后固定脂肪酶活力就不再上升了，由于高溫導(dǎo)致酶失活，酶的最適作用溫度為37 ℃，所以固定脂肪酶時(shí)的溫度不宜太高。

圖3 固定溫度對(duì)固定脂肪酶活力的影響Fig.3 Impacts of the immobilized temperature to the immobilized lipase activity

2.1.4 固定時(shí)間對(duì)固定脂肪酶活力的影響

由圖4 可知隨著處理時(shí)間的增加，固定脂肪酶活力也隨著增加，當(dāng)時(shí)間達(dá)到4 h 時(shí)基本不再變化，說(shuō)明4～6 h 的時(shí)間處理使酶與硅藻土緊密結(jié)合即將脂肪酶固定在硅藻土上。

圖4 固定時(shí)間對(duì)固定脂肪酶活力的影響Fig.4 Impacts of the immobilized time to the immobilized lipase activity

2.2 四元二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 回歸方程的建立及顯著性

根據(jù)單因素試驗(yàn)確定各因素的范圍并進(jìn)行編碼，因素水平編碼見(jiàn)表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

采用Design-Expert.8.0.6 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到固定脂肪酶的活性（y）與硅烷化試劑添加量（x1）、硅藻土與酶質(zhì)量比值（x2）、溫度（x3）和時(shí)間（x4）編碼值的二次回歸方程如下：

y=2 155.39-107.78x1-104.42x2+99.37x3+5.48x4+91.38x1x2-25.79x1x3+40.56x1x4+64.79x2x3+144.95x2x4-172.22x3x4-163.35x12-194.81x22-155.39x32-196.06x42

表1 因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of central composite design

同時(shí)模型的決定系數(shù)R2=0.860 8，校正R2=0.768 0，說(shuō)明該模型能解釋76.80%響應(yīng)值的變化，與實(shí)際試驗(yàn)擬合良好，試驗(yàn)誤差小，證明應(yīng)用四元二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)優(yōu)化硅烷化試劑添加量、硅藻土與酶的質(zhì)量比、固定溫度和固定時(shí)間對(duì)脂肪酶活性的影響是可行的[10]。

表2 四元二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)結(jié)果表Table 2 Results of orthogonal rotating combination test

從表3 中可以得出模型的F 值為9.28，對(duì)應(yīng)的P值＜0.000 1，遠(yuǎn)小于0.01，說(shuō)明模型極顯著，從表3 還可以得出因素一次項(xiàng)（X1、X2和X3）、交互項(xiàng)（X3X4）和二次項(xiàng)（X12、X22、X32和X42）對(duì)試驗(yàn)的結(jié)果影響是極顯著的；交互項(xiàng)（X2X4）也達(dá)到了顯著水平。失擬項(xiàng)的P值為0.542 8，遠(yuǎn)大于0.05，這說(shuō)明該模型擬合程度較好，試驗(yàn)誤差小，所建立的模型是可行的，可以用此模型對(duì)固定化酶的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

2.2.2 響應(yīng)面分析

從表3 可以得到X2X4（P=0.012 8＜0.05）交互作用顯著和X3X4（P=0.004 0＜0.01）交互作用極顯著，采用降維分析法找出在其他因素條件固定不變情況下，某兩個(gè)因素對(duì)固定脂肪酶活性的影響，即硅藻土與酶的質(zhì)量比和時(shí)間交互作用及溫度和時(shí)間的交互作用對(duì)固定脂肪酶活性的影響。圖5 和圖6 是Design-Expert 8.0.6 軟件作出的等高線圖及響應(yīng)曲面圖，對(duì)這些因素中交互項(xiàng)之間的交互效應(yīng)進(jìn)行分析。

圖5 硅藻土與酶的質(zhì)量比和時(shí)間對(duì)固定化脂肪酶活力影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Figure of response surface and contour about quality proportion between diatomaceous earth，enzyme and time to the immobilized lipase activity

圖6 溫度和時(shí)間對(duì)固定化脂肪酶活力影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Figure of response surface and contour about the temperature and time to the immobilized lipase activity

由圖5 可以看出當(dāng)硅烷化試劑添加量為0.4%，溫度為固定28 ℃時(shí)，硅藻土與酶的質(zhì)量比值在2.0～4.0，時(shí)間在3.0～5.0 h 范圍內(nèi)顯著增效作用，固定脂肪酶活力隨著兩因素水平的增加而升高。硅藻土與酶的質(zhì)量比值在4.0～6.0，時(shí)間在5.0～7.0 h 范圍內(nèi)時(shí)，固定脂肪酶的活力隨著兩個(gè)因素的增加反而開(kāi)始降低。由圖6 可知，硅烷化試劑添加量為0.40%，硅藻土與酶的質(zhì)量比值為4 時(shí)，溫度在28～32 ℃，時(shí)間在5～7 h 范圍內(nèi)存在顯著增效作用，固定脂肪酶活力隨著兩因素水平的升高而增加。溫度在24～28 ℃，時(shí)間在3.0～5.0 h 范圍內(nèi)固定脂肪酶活力隨著兩因素水平的升高反而降低。

為了得到最佳的固定化條件值，分析該模型，經(jīng)過(guò)分析可知最佳的固定脂肪酶條件為硅烷化試劑添加量為0.35%、硅藻土與酶的質(zhì)量比為3.5∶1、溫度為29 ℃、時(shí)間為4.5 h。

2.2.3 驗(yàn)證性試驗(yàn)

按上述優(yōu)化的試驗(yàn)條件進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，同時(shí)也考慮到實(shí)際情況，采用硅烷化試劑添加量為0.35%、硅藻土與酶的質(zhì)量比3.5∶1、溫度為29 ℃、時(shí)間為4.5 h，此時(shí)固定后的脂肪酶活力為2 206.67 U·g-1，與預(yù)測(cè)的固定脂肪酶活力相對(duì)誤差為1.27%，因此響應(yīng)分析的模型是可靠的。

3 固定化脂肪酶的重復(fù)利用

固定前脂肪酶的活力為3 000 U·g-1而在最佳的固定化條件下，測(cè)得的固定后脂肪酶活力為2 206.67 U·g-1。雖然酶法在工業(yè)中的應(yīng)用具有反應(yīng)條件溫和、操作簡(jiǎn)便、易于分離、節(jié)約能源、降低消耗等諸多優(yōu)點(diǎn)。但酶的價(jià)格因素限制其在工業(yè)中的應(yīng)用。因?yàn)?，固定化后的脂肪酶的使用壽命也被大家廣泛的關(guān)注。試驗(yàn)在正交試驗(yàn)優(yōu)化出的最佳的試驗(yàn)條件下，重復(fù)使用固定化的脂肪酶，觀察脂肪酶的使用次數(shù)，見(jiàn)圖7。

圖7 使用次數(shù)對(duì)固定化脂肪酶活力與DAG 產(chǎn)率的影響Fig.7 Impact of employ frequency to the immobilized lipase activity and DAG rate

由圖7 可知，固定化后的脂肪酶具有良好的操作穩(wěn)定性，連續(xù)使用7 次后，甘二酯的產(chǎn)率依然可以達(dá)到50%以上，固定化脂肪酶活力仍可達(dá)到1 900 U·g-1以上。這說(shuō)明多次重復(fù)使用后，固定后的脂肪酶仍能保持較好的活性，整個(gè)反應(yīng)體系在上述優(yōu)化條件下有較好的操作穩(wěn)定性，而且本反應(yīng)體系反應(yīng)條件溫和，保持了脂肪酶的良好的催化活性。工藝本身可以在一定程度上節(jié)約脂肪酶的使用成本，有著良好的工業(yè)前景和市場(chǎng)前景。

在固化后的脂肪酶回收方面，試驗(yàn)采用將反應(yīng)后的混合物于4 000 r·min-1離心20 min，用正己烷溶解下層固定脂肪酶殘留反應(yīng)物，抽濾分離固定脂肪酶，得到的固定脂肪酶用正己烷反復(fù)洗滌3 次，晾干后用于下一次試驗(yàn)。

4 結(jié)論

通過(guò)采用四元二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)， 進(jìn)行響應(yīng)面分析結(jié)合驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)確定固定脂肪酶最佳固定化條件為硅烷化試劑添加量為0.35%、硅藻土與酶的質(zhì)量比3.5∶1、溫度為29 ℃、時(shí)間為4.5 h，此時(shí)固定后的脂肪酶活力為2 206.67 U·g-1。在最佳的固定化條件下，硅烷化試劑添加量、硅藻土與酶的質(zhì)量比和溫度對(duì)固定脂肪酶活力影響顯著，因素的主次順序依次為硅烷化試劑添加量、硅藻土與酶的質(zhì)量比、處理溫度、處理時(shí)間，該模型顯著，能說(shuō)明固定的條件對(duì)固定脂肪酶活力的關(guān)系。

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