身痛逐瘀湯通過(guò)調(diào)控P38 MAPK信號(hào)通路抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞一氧化氮的分泌

王健楠，阮洪生，崔玉東，孫虎男

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科技學(xué)院，大慶 163319）

巨噬細(xì)胞活化過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一氧化氮（NO）和超氧陰離子等激進(jìn)分子，這些分子產(chǎn)生與釋放不僅對(duì)細(xì)胞有著一定毒性作用，同時(shí)還參與了許多細(xì)胞的氧化還原過(guò)程[1]。巨噬細(xì)胞存在于幾乎所有的組織當(dāng)中，是重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞。巨噬細(xì)胞可以在機(jī)體損傷和感染時(shí)迅速作出反應(yīng)，同時(shí)一些其他類(lèi)型的有害條件，如缺氧和代謝壓力也可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化。NO 是由精氨酸在一氧化氮合成酶 [nitric oxide synthase（NO S）]的作用下合成的一種重要的生物信使分子[2-3]，參與血流調(diào)節(jié)、信號(hào)傳導(dǎo)、免疫防御等多種生理及病理過(guò)程[3-5]。近年來(lái)，在活化巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)NO 是一個(gè)主要的細(xì)胞毒分子，進(jìn)而引起了關(guān)于NO 在炎癥中及免疫疾病中作用的廣泛研究，體內(nèi)多種組織和細(xì)胞均能合成內(nèi)源性NO（如巨噬細(xì)胞）。巨噬細(xì)胞等在未受到致炎因子刺激時(shí)不表達(dá)iNOS，也無(wú)誘生型NO 的合成，但是在許多致炎因子，如TNFα，IL-1，INF-γ，LPS 等的作用下會(huì)使iNOS 過(guò)量表達(dá)，引起炎癥反應(yīng)的發(fā)生[6-7]。LPS 主要被巨噬細(xì)胞表面LPS 結(jié)合蛋白（LBP）/CD14/ toll-like receptor-4（TLR-4）結(jié)合[8]從而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的活化，誘導(dǎo)NO的過(guò)度釋放、iNOS 的過(guò)表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的水平升高[9-10]，最終引起機(jī)體的敗血癥休克。

通過(guò)對(duì)廣泛文獻(xiàn)的學(xué)習(xí)和整理，在之前的報(bào)道中已經(jīng)闡述了身痛逐瘀湯具有活血化淤，通痹止痛的功效[12]。在臨床上以此方為基本的復(fù)方中藥常用于治療瘀血痹阻等疾病之外，還可用于治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，腰間盤(pán)突出癥以及心血管疾病等[11-13]，這些研究結(jié)果充分地展示出身痛逐瘀湯在各種炎癥治療過(guò)程中的重要作用。但是，目前為止身痛逐瘀湯在由LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞NO 分泌過(guò)程中的效果及其調(diào)控機(jī)理尚不清楚。研究結(jié)果顯示，身痛逐瘀湯通過(guò)選擇性地抑制P38 信號(hào)通路，進(jìn)而有效地抑制了由LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 巨噬細(xì)胞NO 的產(chǎn)生以及iNOS 的表達(dá)，同時(shí)也降低了LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS 水平。研究結(jié)果為進(jìn)一步了解和認(rèn)識(shí)身痛逐瘀湯對(duì)巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

脂多糖（LPS，from Escherichia coli serotype 0111：B4）購(gòu)自Sigma Aldrich 公司，身痛逐瘀湯由（按此藥味組成和劑量，共計(jì)75 g，加入10 倍藥物質(zhì)量的水煎煮0.5 h，煎煮液過(guò)濾。濾渣再加入10 倍藥物質(zhì)量的水煎煮0.5 h，煎煮液過(guò)濾。合并2 次濾液，濃縮至干膏狀。精密稱(chēng)取干膏粉1 g，加入10 倍質(zhì)量的水，超聲提取30 min，用0.45 μm 濾膜過(guò)濾，濾液為供試液），RAW264.7 小鼠巨噬細(xì)胞來(lái)自實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫(kù)。

1.2 試劑及儀器

DMEM/高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，抗mouse anti-JNk、p-JNK、ERK、p-ERK、P38、p-P38 和α-tubulin 單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司。多功能酶標(biāo)儀（TECAN）；流式細(xì)胞儀（BD，F(xiàn)ACS Calibur）；蛋白免疫印跡系統(tǒng)（Amersham Bioscience，美國(guó)）。

1.3 細(xì)胞的培養(yǎng)

RAW264.7 培養(yǎng)在完全培養(yǎng)基（DMEM；Invitrogen），含有10%的胎牛血清（FBS；HyClone，Logan，UT，USA），和1%的抗生素（青霉素和鏈霉素）并置于37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.4 ROS 水平及NO 含量檢測(cè)

ROS 的分析，用ROS 的指示劑（1 mM，CM2-DCFDA）與處理過(guò)的RAW264.7 細(xì)胞在37 ℃孵育15 min 后，用PBS 洗3 次，利用500 uL 的PBS 重懸，利用流式細(xì)胞儀分析10 000 個(gè)細(xì)胞內(nèi)所帶的ROS指示劑的熒光強(qiáng)度。NO 含量檢測(cè)是通過(guò)RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)上清液與10%格里斯試劑室溫下進(jìn)行反應(yīng)10 min 利用多功能酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為540 nm 通過(guò)測(cè)定亞硝酸鹽的含量來(lái)檢測(cè)的。**P≤0.01 ，***P≤0.001，每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡分析

回收細(xì)胞，加入蛋白質(zhì)裂解液4 ℃裂解細(xì)胞20 min。4 ℃，12 000 rpm 離心20 min，提取細(xì)胞總蛋白并定量，再用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺分離20 μg 的細(xì)胞總蛋白，電印跡轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NC 膜（nitrocellulose membranes Millipore，USA）上。將膜用5% Skim milk 封閉1 h，TBST（含有15 mmol·L-1的NaCl 和0.2%Tween-20，10 mmol·L-1的Tris-HCl）洗滌5 次，5 min·次-1，隨后用一抗封閉，4 ℃孵育過(guò)夜。再用TBST 洗滌5 次，5 min·次-1，用與HRP 標(biāo)記的鼠或兔二抗，室溫孵育2 h。棄去二抗，TBST 洗滌5 次，5 min·次-1，即可進(jìn)行ECL 化學(xué)反應(yīng)發(fā)光顯影及結(jié)果分析。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 多組均數(shù)比較采用t 檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，P＜0.01 為差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 身痛逐瘀湯及其單方藥對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞NO 分泌的影響比較

為了比較身痛逐瘀湯（F）與其12 種單方藥（秦艽、川芎、桃仁、紅花、甘草、羌活、沒(méi)藥、當(dāng)歸、香附、牛膝、地龍、靈脂，#1～#12）對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞NO 產(chǎn)生的影響，同樣濃度的12 種單方藥與F 預(yù)處理RAW264.7 細(xì)胞30 min，再用1 μg·mL-1LPS 刺激處理24 h 結(jié)果顯示，只有F 組的處理明顯地抑制了LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞NO 的分泌（圖1）。

圖1 F 與十二種單方藥對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞NO 分泌的影響Fig.1 Effects of F and 12 monotherapy on LPS induced NO production in RAW264.7 macrophages

2.2 身痛逐瘀湯對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 巨噬細(xì)胞的iNOS 的表達(dá)和NO 的產(chǎn)生的抑制

為了進(jìn)一步研究F 對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 巨噬細(xì)胞NO 分泌的抑制效果，RAW264.7 細(xì)胞在不同濃度（1、5、10、15 mg·mL-1）和不同時(shí)間段（0、6、12、24 h）用F 預(yù)處理30 min 后，再用1 μg·mL-1LPS 刺激細(xì)胞24 h，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的NO 含量和細(xì)胞內(nèi)iNOS 蛋白質(zhì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn) 具有濃度和時(shí)間依賴(lài)性地抑制巨噬細(xì)胞NO 的分泌和iNOS 蛋白質(zhì)的表達(dá)（圖2 A、B、C、D）。另外，通過(guò)比較F 與已知的NO 抑制劑（SMT，硫酸甲基異硫脲）對(duì)NO 的抑制效果顯示，SMT（1 μg·mL-1）對(duì)NO 分泌和iNOS 蛋白的抑制效果要優(yōu)于F（圖2 E、F）。

圖2 F 對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 巨噬細(xì)胞NO 產(chǎn)生的抑制和對(duì)iNOS 表達(dá)的影響Fig.2 Effects of F on NO production and iNOS expression in LPS-stimulated RAW264.7 macrophages

2.3 身痛逐瘀湯對(duì)LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活性氧（ROS）產(chǎn)生及對(duì)MAPKs 信號(hào)通路的影響

為了研究F 對(duì)LPS 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生ROS 的影響，F(xiàn)（10 mg·mL-1）預(yù)處理RAW264.7 細(xì)胞30 min，LPS（1 μg·mL-1）分別處理細(xì)胞（0、6、12、24 h）。結(jié)果顯示，F(xiàn) 能夠有效地抑制LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞活性氧水平（圖3A、B）。為了進(jìn)一步檢測(cè)F 對(duì)MAPK信號(hào)通路的影響，RAW264.7 細(xì)胞用F 預(yù)處理30 min，之后用LPS 處理不同時(shí)間段（0、15、30、45 min）。結(jié)果顯示，F(xiàn) 選擇性的抑制了P38 的磷酸化，而對(duì)ERK，JNK MAPKs 信號(hào)通路并沒(méi)有影響（圖3C、D、E）。

圖3 F 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 巨噬細(xì)胞ROS 水平和P38 信號(hào)通路的影響Fig.3 Effects of F on LPS induced RAW264.7 cell ROS levels and P38 signaling pathway

3 討論

在炎性反應(yīng)過(guò)程中巨噬細(xì)胞通過(guò)分泌不同的細(xì)胞炎癥介質(zhì)間接或直接參與各種炎癥性疾病的反應(yīng)過(guò)程。脂多糖（LPS）誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞NO 分泌以及ROS產(chǎn)生，進(jìn)一步導(dǎo)致炎癥的擴(kuò)大[14-15]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單味藥物對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞NO 分泌的抑制作用不明顯，與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。單味中藥作用效果不明顯的原因可能與藥物的提取、精制方法有關(guān)。提取時(shí)采用水煎煮的方法脂溶性成分沒(méi)有溶出，溶出的大多是糖、蛋白質(zhì)、苷類(lèi)等水溶性成分，由于沒(méi)有采用進(jìn)一步的精制工藝，雜質(zhì)多，影響了藥效成分的作用效果。傳統(tǒng)水煎獲得的提取物在抗炎方面的活性不及乙醇提取物，可能中藥抗炎類(lèi)活性成分以脂溶性小分子居多，水煎制劑可能通過(guò)體內(nèi)代謝才能發(fā)揮較強(qiáng)功效[16]，此種闡述與實(shí)驗(yàn)中單味藥物對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞釋放NO 的量抑制作用不明顯的原因分析一致。

活性氧可以激活多種下游的信號(hào)分子，如蛋白激酶C，細(xì)胞分裂素活化蛋白激酶（MAPK）以及核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB），從而調(diào)節(jié)各種各樣的促炎癥因子的表達(dá)。MAPKs 廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)，是一組保守的絲蘇氨酸蛋白激酶。目前已知的MAPKs 家族的主要成員中ERK1/2、JNK1/2、P38 均可參與對(duì)炎癥的調(diào)控。當(dāng)巨噬細(xì)胞受到LPS 刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ROS 水平明顯就會(huì)上升，引起ROS 依賴(lài)性MAPKs 信號(hào)通路的活化，誘導(dǎo)炎性介質(zhì)的過(guò)度表達(dá)進(jìn)而引起自身免疫疾病以及炎癥性疾病。研究中利用LPS 刺激RAW264.7 巨噬細(xì)胞后，可以活化MAPKs 信號(hào)通路，這與前人的實(shí)驗(yàn)研究相吻合[17-18]。F 可以有效地抑制LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平（圖2A、B），因此，認(rèn)為F 必然對(duì)ROS 依賴(lài)性的MAPKs 信號(hào)通路具有調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn) 選擇性地抑制了P38 MAPK 信號(hào)通路，說(shuō)明F 是通過(guò)抑制P38 信號(hào)通路起到抑制NO 分泌地效果。

綜上所述，身痛逐瘀湯可以有效地抑制LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞NO 分泌和細(xì)胞內(nèi)ROS 水平，同時(shí)還可以說(shuō)明這種抑制效果是通過(guò)選擇性地抑制P38 MAPK 信號(hào)通路來(lái)完成的。研究結(jié)果為身痛逐瘀湯在臨床上進(jìn)一步的應(yīng)用與開(kāi)發(fā)提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與理論依據(jù)。

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