成品菊粉中果聚糖含量的液相色譜快速分析方法

孫蕊，賈鵬禹，譚策，王學群，李朝陽，李洪飛，劉憲紅

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學，大慶 163319；2.齊齊哈爾市出入境檢驗檢疫局；3.東北林業(yè)大學大慶 生物技術研究院）

菊粉別名菊糖或譯音成因紐林，是植物中儲備性多糖，其主成分為果聚糖，是2009年我國批準的新資源食品之一。菊粉是水溶性極好的膳食纖維，具有預防齲齒、調(diào)節(jié)脂類代謝、促進鈣吸收、降低血清膽固醇、提高免疫力等功能，可作為功能性配料和雙歧桿菌增殖因子，廣泛應用于功能性食品、飲料、烘焙食品和保健品的制造，同時也是生產(chǎn)低聚果糖、多聚果糖、高果糖漿、結晶果糖等產(chǎn)品的原料[1-4]。2013年，我國黑龍江省建成有亞洲最大的機制菊粉生產(chǎn)線，該生產(chǎn)線采用菊苣根為原料，果聚糖經(jīng)水提取、離子交換和色譜純化，去除蛋白，膠質(zhì)，粗纖維，礦物質(zhì)和雜糖，最后噴霧干燥得到成品菊粉。

成品菊粉中果聚糖含量快速檢測方法是企業(yè)工藝過程控制、產(chǎn)品質(zhì)量控制和全程物料盤點的迫切需求，同時研究采用現(xiàn)代儀器分析測試技術測試菊粉具有方法學意義。已有報道王建華等人采用離子色譜分離幾種不同來源菊糖的方法[5-6]，方法雖能夠區(qū)分組成只有一個單糖單位差異的果聚糖同系物，但離子色譜方法設備依賴性強、儀器相對貴重，不適合廠區(qū)化驗室運用；另有報道張澤生等人用特異性酶進行樣品處理的高效液相色譜方法[7-8]，方法較為繁瑣，耗時長，不適合菊粉企業(yè)生產(chǎn)線“半小時”數(shù)據(jù)反饋的運行機制。首次利用配體交換和尺寸排阻的雙機制分離模式，檢測了成品菊粉中的果聚糖含量，建立了高效液相色譜檢測方法，所建檢測方法收到了滿意的結果。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（型號：1200 美國安捷倫公司），配備：在線脫氣機、自動進樣器、四元梯度泵、示差折光檢測器、柱溫箱、Chemstation 色譜工作站；電子分析天平（感量：0.000 1 g 瑞士梅特勒托利多公司）；真空冷凍干燥機（型號：coolsafe 110-4 丹麥Labogene公司）。

蔗糖、葡萄糖、果糖（標準品，純度均大于99.5%，中國計量科學院）。實驗所用水為超純水，其他試劑均為國產(chǎn)色譜純或分析純試劑；成品菊粉由黑龍江某生物工程科技有限公司提供，高純菊粉由實驗室經(jīng)制備色譜分離自制。

1.2 標準工作曲線繪制與樣品前處理

各精密稱取蔗糖、葡萄糖和果糖標準品100.00 mg，用超純水定容至10 mL 容量瓶中，配制成3 種單糖的混標溶液，再逐級稀釋為標準工作曲線系列溶液。標準溶液經(jīng)0.45 μm 的水相針式濾膜過濾后上機分析，以各濃度對應峰面積做回歸方程。

王躍文先生稱劉誠龍是“文學特工”，他潛伏官場，當了文學特工兼官場深喉，其語言或是“歪嘴和尚”，其立意卻是“觀音菩薩”，他借“一品高官”警示：手清與腦清的“雙清”官員方可為高品質(zhì)高地位之社會棟梁！當今時代，反腐路上，利劍高懸，眼看著省級乃至部級“大老虎”接二連三落馬，拍手稱快過后，憂憤從心底來：浮出水面的“大老虎”，抑或依然深藏的“大老虎”，不歸路成定局，皆因未能“雙清”，而是“零清”：為官既不清廉，腦子亦不清白——如此，焉能為民做主？焉得不被政法“就地正法”，被正義“清理門戶”？《一品高官》給我們奉上的，于高官，是千年不腐的清醒劑；于讀者，是百味雜陳的文化大餐。

綜上所述，為了推行水價改革，發(fā)揮出水價政策的節(jié)水杠桿作用，要深入分析水價和水資源需求之間的關系，圍繞水權配置、設施完善、價格調(diào)整、產(chǎn)權改革、獎補機制、協(xié)會規(guī)范“六位一體”進行綜合改革。進一步加強水資源管理，加快水管單位體制改革，規(guī)范計量設施，落實節(jié)水措施，促進農(nóng)業(yè)節(jié)水和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展，有效提高供水效率與供水效益，從而實現(xiàn)用水戶節(jié)水意識的提升，達到農(nóng)業(yè)增效、農(nóng)民增收的目的。

1.3 液相色譜條件

實驗考察了樣品中各組分的分離情況，由圖1可見，經(jīng)標準品保留時間定性，其中雜糖組分蔗糖、葡萄糖和果糖分別在13.3 min，14.7 min 和15.4 min處洗脫，樣品分離在16 min 內(nèi)完成，各目標峰位分離情況良好。

1.4 定性與定量方法

綜上，實驗選擇了Na 型配位體交換和尺寸排阻雙模式進行樣品組分分離，此外，根據(jù)尺寸排阻的分離機理，分子量大的組分先出峰，可以對樣品的特性作出判斷[12]，如圖1 中，樣品C 和樣品D 的峰位坐標比較（左側紅線）顯示出樣品C 的果聚糖分子量大的組分多于樣品D（樣品C 灰色區(qū)域的面積比樣品D 大）。

實驗比較了未加帶尺寸排阻作用的Ca 配位體交換和加帶尺寸排阻作用的Na 配位體交換色譜柱對樣品中主要組分的分離效果，樣品采用圖1 中B樣品，Ca 配位體交換色譜柱采用了Rezex RCMMonosaccharide Ca+2（8%），300×7.8 色譜柱（美國Phenomenex 公司），全水流動相，流速0.55 mL·min-1，柱溫80℃；示差折光檢測器，樣品在優(yōu)化的色譜條件下分離情況如圖2 所示，可見色譜柱對果聚糖組分未具有較好的選擇性，其在目標物分離優(yōu)勢上較帶有尺寸排阻的Na 柱差。

2 結果與討論

2.1 方法適應性

色譜柱：Shodex SUGAR KS-802（300 mm×8 mm ID，6 μm），配同系保護柱SUGAR（50×8 mm ID，6 μm）；流動相：100% 純水；流速：0.55 mL·min-1；經(jīng)典柱壓：40 Bar；柱溫：80 ℃；示差檢測器溫度：35 ℃；進樣量：10 μL。

樣品稱量前采用真空冷凍進行干燥處理，準確稱取5.00 g 樣品，用水溶解并定容至100 mL，樣液經(jīng)0.45 μm 的水相針式濾膜過濾后上機分析。

2.2 分離柱的選擇

三系雜交種皖芝10號參加2013年安徽省芝麻新品種區(qū)試，產(chǎn)量為1 498.50 kg/hm2，比對照品種豫芝4號增產(chǎn)2.04%，2014年通過安徽省鑒定。2015—2016年全國(江淮片)芝麻品種區(qū)域試驗，兩年平均產(chǎn)量1 261.65 kg/hm2，比豫芝4號(CK)增產(chǎn)2.54%；含油量為58.18%，蛋白質(zhì)含量20.97%；莖點枯和枯萎病病情指數(shù)分別為5.07和0.85。該品種具有優(yōu)質(zhì)、高油、高產(chǎn)、多抗、綜合性狀優(yōu)于全國對照品種豫芝4號等特點，適合制油、食品保健。

菊粉成分主要由線型果聚糖、蔗糖、葡萄糖和果糖等雜糖組成。線型菊糖型果聚糖（linear inulin）是果聚糖的一種天然存在形式，由線性β（2-1）鍵連接1 個或多個呋喃果糖形成，線型菊糖型果聚糖屬菊類植物如菊芋、菊苣等特有[4]，現(xiàn)今世界上菊粉加工中所用原料多采用菊芋或菊苣生產(chǎn)，其中菊苣占有相當?shù)谋戎?。線型菊糖型果聚糖和其他雜糖均具有糖類物質(zhì)的多羥基結構，因此在糖類物質(zhì)的色譜分離機制上，配位體交換色譜法是較好的選擇[9-11]；另外，對于樣品中的多糖組分，考慮到果聚糖是聚合度不同的多聚體，在分離中我們增加了尺寸排阻作用，提高了色譜柱的選擇性。

樣品中果聚糖含量：樣品重量A0減去雜糖（蔗糖B1、葡萄糖B2和果糖B3）總重A1，所得之差即為果聚糖重量，由果聚糖重量比樣品重量即得菊粉中果聚糖的百分含量；各雜糖含量均采用外標法定量測得。果聚糖含量用公式表示為：

組分定性方式采用保留時間定性方法。

圖1 樣品色譜圖Fig.1 Chromatogram of sample

圖2 樣品B 色譜圖Fig.2 Chromatogram of sample B

2.3 回歸方程、線性范圍與檢測限

實驗對三種雜糖組分進行線性范圍考察，根據(jù)峰面積Y 對各雜糖濃度X（mg·mL-1）進行線性回歸，依據(jù)三倍噪聲計算檢測限。結果見表1。

表1 線性回歸方程（n=6）Table 1 The linear regression equations（n=6）

2.4 方法精密度和回收率

實驗考察了方法精密度，在同批次樣品中取出樣品6 份，分別按照1.2 流程進行前處理，分別進樣考察各組分峰面積的相對標準偏差，蔗糖、葡萄糖和木糖的精密度（RSD，n=6）分別為：0.83%、0.98%和1.06%，相對標準偏差均遠小于4.6%，方法的穩(wěn)定性較高；實驗采用實際樣品中定量加入混標的方式進行了回收率實驗，采用外標法定量，測得單糖平均回收率在99.1%～100.8%之間。結果見表2。

因此，在新背景下，開展3D打印技術人才的培養(yǎng)研究相當重要，高校如何培養(yǎng)能夠滿足社會需求的專業(yè)人才，值得探索。

盡管如此，伊朗不會輕易放棄已取得的成績，必將采取各種方法鞏固陣營，并繼續(xù)在“新月帶”的滲透，未來該地區(qū)將會陷入長期動蕩。如果伊朗深陷地區(qū)爭端無法抽身，勢必影響其經(jīng)濟發(fā)展，由此帶來的國內(nèi)經(jīng)濟壓力將會激化國內(nèi)改革派和保守派兩大勢力的矛盾，甚至可能發(fā)生內(nèi)亂。如果美國制裁導致伊朗政權的執(zhí)政受到威脅，有可能導致執(zhí)政當局鋌而走險，甚至采取極端手段使地緣局勢惡化。

表2 精密度與回收率（n=6）Table 2 The recovery and precision（n=6）

2.5 樣品測試結果

實驗對3 個不同類型的樣品（生產(chǎn)、市售和自制高純）進行了檢測，不同樣品所得各結果見表3，表中數(shù)據(jù)可以看出，生產(chǎn)產(chǎn)品和市售商品均已達到了新資源食品對菊粉成品的含量要求。實驗同時比較了各樣品經(jīng)過長時間自然敞開放置的組分含量變化，可見菊粉樣品隨存放時間的延長，果聚糖發(fā)生降解導致果糖含量增加。

表3 樣品測定結果（ND：未檢出）Table 3 Test results of samples

3 結論

通過配位體交換和尺寸排阻雙分離模式高效液相色譜實現(xiàn)了成品菊粉中果聚糖含量的測定，方法簡便易操作，快速穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，可為菊粉企業(yè)生產(chǎn)工藝提供了快速準確數(shù)據(jù)；該方法所需儀器機型配置簡單，儀器成本和運行成本投入小，適合企業(yè)運作，方法操作簡單，易于移植；此方法硬件系統(tǒng)中檢測器也可采用靈敏度更高的蒸發(fā)光散射（ELSD）作為檢測器配置以提高方法靈敏度，相比較示差折光檢測器而言，應用ELSD 可將檢測靈敏度提高10 倍。

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