同步去除氨氮和鐵、錳的濾池中細菌群落解析

李 濤，沙 凈，韓 珀

(鄭州自來水投資控股有限公司，鄭州450013)

由于黃河中下游汾河、涑水河、渭河和伊洛河等入黃支流污染物排放量大，氨氮已成為黃河干流的主要污染物之一，不但直接影響著黃河中下游鄭州等大中城市的地表水水源水質(zhì)，而且被污染的黃河水在入滲補給地下水的過程中對沿岸地下水也造成不同程度的影響，因此一些沿黃城市的地下水中除了常見的鐵、錳等污染物外，還存在著較嚴重的氨氮污染.利用錳砂作為填料的接觸氧化法是目前去除地下水中鐵、錳的最常用的技術(shù).然而，隨著錳砂濾池的長期運行，硝化細菌也逐漸附著錳砂生長，因而錳砂濾池也會成為硝化生物濾池[1].如果進水溶解氧充足，則能在同一濾池同時實現(xiàn)鐵、錳和氨氮的去除[2－3].

生物濾池內(nèi)微生物群落的解析有助于了解污染物的去除機制，從而能更有效地設(shè)計和運行管理生物濾池[4].目前有別于傳統(tǒng)培養(yǎng)法的分子生物學技術(shù)對飲用水生物濾池中微生物群落結(jié)構(gòu)分析成為飲用水研究的一個熱點，然而，這些研究主要集中于處理地表水的生物濾池[4－8]，目前關(guān)于地下水生物濾池中微生物群落結(jié)構(gòu)分析的研究報道仍極其有限[1，9]，國內(nèi)外尚未見關(guān)于鐵、錳和氨氮同步去除的錳砂濾池的微生物群落結(jié)構(gòu)分析的研究報道，因而本研究主要研究目的是:針對黃河沿岸地下水為水源的鄭州市東周水廠的錳砂濾池，利用分子生物學技術(shù)進行濾池內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)的解析，并探討微生物與污染物去除的內(nèi)在關(guān)系，為今后同步去除氨氮和鐵、錳的地下水砂濾池的設(shè)計和運行管理提供微生物學基礎(chǔ)信息.

1 試驗裝置及方法

1.1 試驗裝置及運行參數(shù)

鄭州市東周水廠的錳砂濾池為雙閥濾池，設(shè)計能力為20萬m3/d.雙閥濾池分為東、西兩個濾池.每個濾池各有8格池子組成，共計16格池子.每格濾池的濾層厚度為1.2 m，濾料粒徑為0.6～1 mm石英砂，經(jīng)長期運行后熟化成為錳砂.濾池過濾速度為10.2 m/h，采用單獨水沖的反沖洗方式.長期的監(jiān)測資料表明，東周水廠原水中鐵質(zhì)量濃度約為1.1 ～1.4 mg/L，錳約為0.05 ～0.14 mg/L，經(jīng)過錳砂濾池去除后，出水能達到我國飲用水水質(zhì)的標注(即鐵質(zhì)量濃度不大于0.3 mg/L，錳質(zhì)量濃度為不大于0.1 mg/L).而原水中氨氮平均值約為0.27 mg/L，濾池出水中氨氮平均值為0.04 mg/L，亞硝酸鹽氮通常低于檢測限，說明錳砂濾池已經(jīng)成為硝化生物濾池.

1.2 細菌群落分析方法

用于微生物分析的樣品采集與距濾層表面0.4 m處的錳砂.采用美國Mobio公司的強力土壤DNA提取試劑盒提取樣品總DNA，具體DNA提取方法參照試劑盒產(chǎn)品說明書.提取的DNA放于–20℃保存以待后續(xù)的微生物學分析.采用細菌通用引物27F(5'－AGAGTTTGATCMTGGCTCAG－3')和 1492R(5'－GGTTACCTTGTTACGACTT－3')進行擴增.采用50 μL的 PCR反應(yīng)體系:25 μL2 × Taq PCR MasterMix;2 μL 正反引物;21 μL DNA模板.反應(yīng)條件:94℃預變性5 min;94℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s，72℃延伸 90 s，共 30 個循環(huán);最終72℃延伸10 min.PCR擴增產(chǎn)物純化后進行克隆文庫的構(gòu)建，具體方法與文獻一致[4，10].

將所得陽性克隆子送往北京諾賽基因組研究中心有限公司測序，用美國密西根州立大學的在線數(shù)據(jù)庫 Ribosomal Database Project II(下文簡稱RDP)分析各序列的微生物學種類.采用DOTUR程序?qū)寺∥膸熘械男蛄羞M行操作分類單元(OTU)劃分，把相似性為97%或以上的序列聚類成一個OTU，然后進行細菌群落多樣性指數(shù)的計算[4].選取每個 OTU中的一個代表性序列用BLAST在GenBank中搜索相近序列和進行相似性比對.(本研究所得克隆文庫中細菌序列在Gen-Bank中登記號為:KC414945－KC415002).

2 結(jié)果與討論

本研究中構(gòu)建的細菌克隆文庫有58個克隆子構(gòu)成，克隆文庫的覆蓋率在90%，因而覆蓋度較高.從稀釋曲線(圖1)可以看出，構(gòu)成文庫的克隆子采集樣品數(shù)已經(jīng)充分.文庫僅可以劃分成10個OTUs，Chao1指數(shù)和 Shannon指數(shù)分別是 15和1.05，說明錳砂填料上附著的細菌群落多樣性較低.Li等采用克隆文庫方法分析了處理地下水的生物活性炭濾池中細菌群落，發(fā)現(xiàn)濾池內(nèi)細菌群落的 Shannon 指數(shù)為3.77 ～2.93[9].Liao 等采用克隆文庫方法分析了處理地表水的升流式生物活性炭濾池系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)濾池內(nèi)細菌群落的Shannon指數(shù)為1.0 ～2.9[4].由于錳砂的比表面積和表面粗糙度要比活性炭小，因而不利于微生物附著生長，這也可能是錳砂濾池中細菌群落多樣性較小的一個主要原因.同時，生物濾池內(nèi)微生物群落的多樣性還與其它很多因素有關(guān)(如基質(zhì)種類和質(zhì)量濃度、營養(yǎng)物質(zhì)量濃度、采樣點部位、水力停留時間、濾池運行周期等)[8].

圖1 文庫的稀釋曲線分析

圖2反映了克隆文庫中細菌序列的門綱分布，可以看出，錳砂填料上細菌屬于變形桿菌門(Proteobacteria)或硝化螺旋菌門(Nitrospirae).硝化螺旋菌門成為優(yōu)勢菌(相對豐度為81%)，而α變形桿菌綱(Alphaproteobacteria)、β變形桿菌綱(Betaproteobacteria)、γ變形桿菌綱(Gammaproteobacteria)和δ變形桿菌綱(Deltaproteobacteria)的相對豐度分別只有6.9%、1.7%、6.9% 和 3.4%.以往的研究資料表明，飲用水生物濾池中優(yōu)勢菌一般都為α變形桿菌綱[4，8]，或 β 變形桿菌綱[5，9].然而，本研究中α變形桿菌綱和β變形桿菌綱都沒能成為優(yōu)勢菌，這主要是可能是地下水中有機物含量很低，TOC 只有 0.1～0.2 mg/L，因而限制了異養(yǎng)細菌的生長.硝化螺旋菌門的細菌屬于亞硝酸鹽氧化菌，而其在每個樣品中占據(jù)絕對優(yōu)勢，說明各濾池中存在強烈的硝化作用而已經(jīng)成為硝化生物濾池，這主要與原水中氨氮質(zhì)量濃度較高有關(guān).而也有文獻報道，對于存在氨氮污染的地下水原水，硝化螺旋菌門也在砂濾池中成為優(yōu)勢菌[1].

圖2 克隆文庫中細菌序列的門綱分布

表1反映了克隆文庫中各OTU中代表性序列的進化發(fā)育情況，可以看出，大多數(shù)序列可以分類到屬的水平，有3個細菌屬被檢出，即硝化螺旋菌屬(Nitrospira)、Pseudolabrys和生絲微菌屬(Hyphomicrobium).硝化螺旋菌屬可將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽，而來自3個OTUs中的49個克隆子屬于硝化螺旋菌屬，OTU1中的代表性序列ZC39和OTU5中的代表性序列ZC48的最相似的分離菌也都來自硝化反應(yīng)器[11－12]，因而也間接解釋了錳砂濾池能高效去除氨氮并且出水中亞硝酸氮低于檢測限的原因.de Vet等也發(fā)現(xiàn)硝化螺旋菌屬是一個生產(chǎn)性地下水砂濾池中惟一的亞硝酸鹽氧化菌[1].如果需要進一步研究氨氧化細菌去除氨氮的機制，則將來可以設(shè)計專門的引物進行檢測[7].生絲微菌屬(Hyphomicrobium)是常見的錳氧化細菌[13]，而它的存在說明濾池中錳氧化細菌都可能對錳的去除起了重要作用.生絲微菌屬是異養(yǎng)細菌，與自養(yǎng)性的硝化螺菌相比，生長相對較快，因而在硝化生物濾池中仍能生長.硝化螺旋菌屬和生絲微菌屬的共存解釋了硝化濾池內(nèi)生物除錳的可行性.然而，本文并沒有發(fā)現(xiàn)錳砂濾池中與鐵氧化有關(guān)的細菌.這說明該工藝中鐵氧化主要由曝氣作用完成，微生物發(fā)揮的作用可以忽略.

表1 克隆文庫中克隆序列分類和數(shù)量

3 結(jié)語

鄭州市東周水廠的生產(chǎn)性錳砂濾池填料上附著的細菌群落多樣性較低，而硝化螺旋菌門是優(yōu)勢菌.錳砂濾料上檢測出了硝化螺旋菌屬、Pseudolabrys和生絲微菌屬.硝化螺旋菌屬和生絲微菌屬的共存解釋了硝化濾池內(nèi)生物除錳的可行性，但沒有檢測出錳砂濾池中與鐵氧化有關(guān)的細菌.

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