流式細胞儀檢測線粒體膜電位方法的研究

岳 磊，張 垚，張楠曦

(哈爾濱工業(yè)大學生命科學與技術學院，哈爾濱150080)

細胞活動的能量主要來自ATP，而80% 以上的ATP是在線粒體中合成的.線粒體是糖、脂肪和氨基酸最終氧化釋放能量的場所，線粒體為一雙層膜圍成的囊狀結構，外膜與內(nèi)膜間的空腔稱為外室，由內(nèi)膜包圍的腔稱為內(nèi)室或線粒體基質(zhì).線粒體外膜通透性較大，分子質(zhì)量在15 ku以下物質(zhì)可自由通過，因此胞質(zhì)成分與線粒體外室基本相似.線粒體內(nèi)膜通透性小，分子質(zhì)量大于1.5 ku物質(zhì)不易通過，但內(nèi)膜存在一些載體蛋白與通道以便運輸某些物質(zhì).質(zhì)子泵存在于內(nèi)膜，它將基質(zhì)內(nèi)質(zhì)子泵入外室，從而形成橫跨線粒體內(nèi)膜的線粒體跨膜電位(mitochondrial membrane potential，用 Δψm表示)[1－3].跨膜電位內(nèi)室為負，外室為正.事實上，Δψm的變化可以暗示著線粒體蛋白復合體的結構改變、細胞色素C的釋放、ATP合成不足等多種線粒體功能相關變化，也可以提示由線粒體通路介導的細胞凋亡、細胞死亡、細胞自噬等細胞機體的產(chǎn)生機理.

流式細胞儀(Flow Cytometer，F(xiàn)CM)是以流式細胞術為核心技術，集光學、電子學、流體力學、細胞化學、生物學、免疫學以及激光和計算機等多門學科和技術于一體的先進科學技術設備[4].它可以對快速直線流動狀態(tài)中的單列細胞或生物顆粒進行逐個、多參數(shù)、快速的定性、定量分析或分選，具有檢測速度快、測量參數(shù)多、采集數(shù)據(jù)量大[5]、分析全面、分選純度高、方法靈活等特點，是現(xiàn)代科學研究中的先進儀器之一.本文采用常見的4種檢測線粒體膜電位的熒光染料，通過流式細胞儀進行比較，以判定每種方法的優(yōu)缺點.

1 材料和方法

1.1 實驗儀器

CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma);流式細胞儀(BD FACSCalibur);紫外交聯(lián)儀(Gene CL－1000);低速臺式離心機(TDL－40C);臺式微量冷凍離心機(Beckman X－22R)

1.2 細胞及主要試劑

人類宮頸癌細胞Hela由哈爾濱工業(yè)大學生命科學與技術學院提供;羅丹明123和JC－1試劑盒購自北京碧云天公司;TMRE購自Invitrogen公司;DiOC6(3)熒光染料購自Sigma公司.

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

Hela細胞培養(yǎng)于含體積分數(shù)為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，并加入100 IU/mL青霉素及100 IU/mL鏈霉素，置37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實驗時取對數(shù)生長期細胞.

1.3.2 實驗對照組

對照組為未處理的Hela細胞組，實驗組Hela細胞經(jīng)UV照射后，培養(yǎng)24 h，收集細胞，各組細胞終濃度均為5×105個/mL.

1.3.3 羅丹明123檢測法

取對數(shù)生長期細胞，胰酶EDTA消化，用PBS制成細胞懸液，PBS漂洗2次(1 500 r/min，10 min)，加入0.5 mL羅丹明123染液(5 mg/L)(避光操作)，培養(yǎng)箱中染色30 min，用PBS清洗1次(1 500 r/min，10 min)，過200目尼龍網(wǎng)，流式細胞儀檢測，激發(fā)波長為488 nm.

1.3.4 DiOC6(3)檢測法

取對照組和實驗組細胞，胰酶EDTA消化，用PBS制成細胞懸液，PBS漂洗2次，加入DiOC6至終濃度40 nmol/L，室溫避光孵育20 min，流式細胞儀分析前PBS緩沖液洗滌細胞.

1.3.5 TMRE 檢測法

取對照組和實驗組細胞，胰酶EDTA消化，用PBS制成細胞懸液，PBS漂洗2次，加入TMRE至終濃度為100 nmol/L，37℃孵育30 min，用PBS清洗1次，流式細胞儀檢測.

1.3.6 JC －1 檢測法

取對數(shù)生長期細胞，胰酶EDTA消化，用PBS制成細胞懸液，PBS漂洗2次，終濃度JC－1(1 mmol/L)進行染色，37℃平衡30 min，流式細胞儀檢測細胞的熒光強度(具體步驟參照試劑盒說明書).

2 實驗結果

圖1～3為單色熒光染料結果分析的直方圖，圖中橫坐標為熒光道數(shù)，表示相對熒光強度，縱坐標表示細胞數(shù).以對照組為參照圖，在主峰的左側設置門M1，門內(nèi)的數(shù)值表示熒光強度下降的細胞百分數(shù).

2.1 羅丹明123熒光染料檢測

羅丹明123是一種可透過細胞膜的陽離子熒光染料，是一種線粒體跨膜電位的指示劑.正常細胞中能夠依賴線粒體跨膜電位進入線粒體基質(zhì)，熒光強度減弱或消失.而在線粒體膜完整性被破壞時，線粒體膜通透性轉運孔開放，羅丹明123重新釋放出線粒體，發(fā)出強黃綠色熒光[6].羅丹明123檢測結果如圖1所示.從圖1中可以看出，處理組(29.83%)與對照組(4.21%)相比，門 M1的細胞百分數(shù)增多，疊加圖中也清晰的看到處理組的峰左移，結果表明UV照射后的Hela細胞羅丹明123熒光強度減弱，Δψm明顯降低.

2.2 DiOC6(3)熒光染料檢測

DiOC6(3)是一類親脂性熒光染料，用于標記細胞膜和疏水性組織.這是一類環(huán)境敏感型熒光染料，當它與膜結合或者與親脂性生物分子(例如蛋白質(zhì)，雖然在水中其熒光強度很弱)結合時，其熒光強度顯著增強.它們具有很高的淬滅系數(shù)，偏光依賴性和很短的激發(fā)壽命.一旦應用于細胞中，這種染料會在細胞內(nèi)質(zhì)膜中逐步擴散，導致在其最佳濃度條件下，將整個細胞染色.488 nm激發(fā)時最大發(fā)射波長為527 nm，呈綠色熒光[7－8].DiOC6(3)檢測結果如圖2所示.從圖2中可以看出，處理組(19.07%)與對照組(3.76%)相比，門 M1的細胞百分數(shù)增多，疊加圖中能看到處理組的峰左移，說明UV照射后的Hela細胞Δψm降低.

圖1 羅丹明123試劑檢測結果

圖2 DiOC6(3)試劑檢測結果

2.3 TMRE熒光染料檢測

TMRE熒光探針為一種帶正電荷、對細胞通透、無毒的熒光染料，其激發(fā)光波長為543 nm，發(fā)射波長為560 nm.在正常生理條件下，線粒體膜的電壓為內(nèi)負外正，帶正電的TMRE可迅速進入并聚集在線粒體內(nèi).mPTP的開放使線粒體的膜電位消失，導致TMRE從線粒體釋放，因此線粒體內(nèi)TMRE熒光強度變化可以適當?shù)胤从尘€粒體膜電位的高低[9－11].TMRE 檢測結果如圖3所示，該試劑選用FL2通道，處理組(13.65%)與對照組(3.23%)相比，熒光強度減少10.42%，結果表明UV照射后的Hela細胞TMRE熒光強度減弱，Δψm降低.

圖3 TMRE試劑檢測結果

2.4 JC－1熒光染料檢測

JC－1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位的陽離子型親脂性熒光探針，能夠自由穿過細胞膜，隨細胞膜電位的變化而在膜兩側保持動態(tài)平衡..可以檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位.在線粒體膜電位較高時，JC－1聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，可以產(chǎn)生紅色熒光，激發(fā)波長為490 nm，發(fā)射波590 nm;在線粒體膜電位較低時，JC－1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時JC－1為單體，可以產(chǎn)生綠色熒光，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為529 nm.這樣就可以非常方便地通過熒光顏色的轉變來檢測線粒體膜電位的變化[12].JC－1試劑檢測結果如圖4所示.由于JC－1在檢測時發(fā)出兩種熒光，因此其結果分析采用二維散點圖，用“十”字門將圖譜分成四個象限.右上象限(UR)表示JC－1在細胞內(nèi)以聚合物形式存在，發(fā)出紅色熒光;右下象限(LR)表示JC－1在細胞內(nèi)以單體形式存在，發(fā)出綠色熒光.由圖4可以看出，Hela細胞經(jīng)UV照射后，處理組(16.40%)與對照組(4.46%)相比，綠色熒光明顯增強，表示JC－1單體形態(tài)增多，提示UV處理后的細胞Δψm降低.

圖4 JC－1試劑檢測結果

3 討論

研究結果表明，4種熒光染料均可以用流式細胞儀進行線粒體膜電位的檢測.但由于每種染料的檢測原理不同，在染液濃度及孵育時間上也不同，在實際實驗中還要根據(jù)不同的實驗目的選擇不同的染料.

羅丹明123是流式細胞儀檢測Δψm的常用熒光染料，它與線粒體結合能力較高，容易破壞電子傳遞鏈(ETC)，并且釋放緩慢，因此在瞬時熒光染料釋放期間減少對膜電位變化的影響.羅丹明123這一特點，使得它成為實時檢測細胞急性損傷中線粒體膜電位變化的首選熒光染料.

DiOC6(3)檢測Δψm的方式與羅丹明123比較相似，但與其他熒光染料相比較，DiOC6(3)對線粒體呼吸有較高的毒性，并且由于其實驗用劑量較低，使得該染料對試驗操作的精準度要求較高.這兩種染料在流式細胞儀上均用FL1通道檢測[13].

TMRE是一種在非淬滅模式下檢測Δψm的熒光染料，它與線粒體結合能力較弱，并且釋放迅速，適用于檢測慢性損傷細胞中線粒體膜電位的變化，或者檢測不同方法處理的各實驗組Δψm差異，在流式細胞儀中用FL2通道檢測.

與上述單色熒光探針不同，JC－1在檢測線粒體膜電位時是通過聚集體與單體的光譜轉換來獲得熒光信號，因此JC－1往往被認為是可靠的Δψm指示劑.由于JC－1有較強的光敏感性，并且它的聚集體不能快速的與單體達到平衡狀態(tài)，因此在使用JC－1染料時要特別注意探針的使用濃度和反應時間.JC－1一般更多的用于細胞凋亡早期線粒體膜電位變化的檢測[14－15].

本實驗采用紫外照射的方式誘導細胞產(chǎn)生凋亡，大量實驗研究表明，在細胞凋亡中，線粒體起著中心調(diào)控作用，而且在凋亡的早期階段，首先發(fā)生的是線粒體膜電位的改變.通過這一特點，我們考察了4種熒光染料對在細胞凋亡中Δψm變化的指示作用.結果顯示:羅丹明檢測到的 Δψm變化較大，實驗組與對照組比較相差25.62%，這可能與羅丹明123適用于檢測細胞急性損傷中線粒體膜電位變化相關.

不僅僅是細胞凋亡，在其他線粒體調(diào)控機制中，線粒體膜電位的變化也是重要監(jiān)測指標之一.隨著科學技術的發(fā)展，流式細胞儀已實現(xiàn)多個激光器獲得多色熒光參數(shù)，同時完成分類、實現(xiàn)實時同步分析的功能，這大大提高了流式細胞儀的應用范圍及精確度，也使其成為檢測線粒體膜電位的重要科學手段.由于每個染料的檢測原理不同，與線粒體的結合方式不同，在實際應用中要根據(jù)不同的實驗選擇不同的染料，以保證獲得較為準確的實驗結果.

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