卵母細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間對(duì)單精子胞漿內(nèi)注射胚胎質(zhì)量及妊娠結(jié)局影響

乜照燕吳海峰張 娜甄秀麗張 軼郭麗娜趙素英. 河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院（石家莊 0500）; . 河北省胸科醫(yī)院

卵母細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間對(duì)單精子胞漿內(nèi)注射胚胎質(zhì)量及妊娠結(jié)局影響

乜照燕1*吳海峰2張 娜1甄秀麗1張 軼1郭麗娜1趙素英1
1. 河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院（石家莊 050011）; 2. 河北省胸科醫(yī)院

摘要目的 探索單精子卵胞漿內(nèi)注射（ICSI）前最適合的卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)間，即取卵結(jié)束到開始ICSI的時(shí)間（t），以利于取得高的受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率和良好的妊娠結(jié)局。方法 根據(jù)卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)間，將患者分為 3 組：A 組為2 h＜t＜4 h，（n =174），B 組為4 h＜t＜6 h，（n =147），C 組為t≥6 h，（n =82）。回顧性分析卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)間對(duì)ICSI 患者的受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率及臨床結(jié)局的影響。結(jié)果 （1）A組與B組受精率（81.5% vs 83.5%）、卵裂率（98.9% vs 97.5%）、優(yōu)質(zhì)胚胎率（46.9% vs 45.5%）、植入率（36.7% vs 32.8%）、妊娠率（55.2% vs 51.7%）及流產(chǎn)率（12.5% vs 13.2%）比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（2）C組受精率（88.3%）顯著高于A 組和B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。C組優(yōu)質(zhì)胚胎率（41.6%）、植入率（18.7%）、妊娠率（30.7%）均低于A 組和B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。C組卵裂率（98.9%）、流產(chǎn)率（12.0%）與A組和B組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 過長(zhǎng)卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)間（≥6 h）可以有高的受精率，但優(yōu)質(zhì)胚胎率降低，不利于改善 ICSI 患者的臨床結(jié)局；卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)2～6h后進(jìn)行ICSI可以獲得較為理想的臨床結(jié)局。

關(guān)鍵詞卵母細(xì)胞; 體外受精; 精子注射, 細(xì)胞質(zhì)內(nèi); 胚胎發(fā)育

單精子胞漿內(nèi)注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于輔助生殖領(lǐng)域，成為治療男性不育的重要方法。但取卵后何時(shí)進(jìn)行ICSI是最佳的授精時(shí)機(jī)，至今尚無共識(shí)性的標(biāo)準(zhǔn)化操作程序（SOP ），不同實(shí)驗(yàn)室在授精時(shí)機(jī)操作上存在差異， 這些差異是否會(huì)導(dǎo)致妊娠結(jié)局的不同?目前的研究尚未得到統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。本研究回顧性分析了卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)間對(duì)于 ICSI 患者的受精、胚胎發(fā)育以及臨床結(jié)局的影響，以期探索最適合的 ICSI時(shí)機(jī)。

資料與方法

一、研究對(duì)象

研究對(duì)象為 2012 年1 月至2013年12月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院接受ICSI 治療的患者。患者的入選標(biāo)準(zhǔn)為：患者由于單純男方因素行ICSI 治療，女方年齡≤35 歲，基礎(chǔ)內(nèi)分泌正常。根據(jù)從患者取卵結(jié)束到開始進(jìn)行 ICSI 的時(shí)間（t），將患者分為 3 組：A 組（2 h≤t＜4 h，n =174），B 組（4 h≤t＜6 h，n =147），C 組（≥6 h，n =82）。

二、控制性促排卵

采用長(zhǎng)方案控制性超排卵，于排卵后第7天給予醋酸曲普瑞林0.1mg （商品名：達(dá)必佳，0.1mg/支，德國(guó)輝凌制藥有限公司，注冊(cè)證號(hào)：H20100365）皮下注射，第14天左右給予注射用重組人促卵泡激素（FSH）150～225IU（商品名：果納芬，75IU/支，瑞士默克雪蘭諾有限公司，注冊(cè)證號(hào)：S20080030） 啟動(dòng)促排卵，當(dāng)主導(dǎo)卵泡中有1個(gè)直徑達(dá)18 mm或2個(gè)達(dá)17 mm或3個(gè)達(dá)16mm，雌激素達(dá)到每個(gè)卵泡約200～300 pg/mL，給予注射用重組人絨促性激素（HCG）250 μg（商品名：艾澤，250μg /支，瑞士默克雪蘭諾有限公司，注冊(cè)證號(hào)：S20110045），36～37 h后取卵，取卵當(dāng)天為D0。將獲取的卵冠丘復(fù)合物 （oocyte- coronacumulus complex）轉(zhuǎn)移到 G- IVF 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

三、顯微注射

實(shí)施顯微注射前1h去除顆粒細(xì)胞，先將卵子置于預(yù)熱的含80～100IU/mL透明質(zhì)酸酶的G-Mops培養(yǎng)液中連續(xù)吹打數(shù)次，控制在1min以內(nèi)，然后將其吸出置于G-Mops培養(yǎng)液中，換用內(nèi)徑稍大于卵子的毛細(xì)玻璃管繼續(xù)吹打，直到完全去除顆粒細(xì)胞。將卵子移至G-IVF培養(yǎng)液中等待授精，注射前先在倒置顯微鏡下觀察卵子的質(zhì)量及成熟度，觀察卵胞漿內(nèi)是否有空泡或其他畸形并記錄。注射時(shí)將第一極體置于11點(diǎn)處，避免注射過程對(duì)卵母細(xì)胞紡錘體的損傷。注射時(shí)盡可能少的注入PVP液。最后將注射后的卵子用培養(yǎng)液沖洗后置GM皿中培養(yǎng)。

四、受精觀察和胚胎評(píng)估

使用 G5 系列培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行胚胎體外培養(yǎng)（瑞士 Vitrolife 公司）。受精后 16～18 h（第 1 天）根據(jù)Scott 的原核評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[1]對(duì)卵母細(xì)胞的受精情況進(jìn)行評(píng)估， 第 3 天對(duì)胚胎卵裂球數(shù)目、形態(tài)以及碎片比例進(jìn)行評(píng)估。達(dá)到以下標(biāo)準(zhǔn)的為優(yōu)質(zhì)胚胎：（1）胚胎卵裂球數(shù)目＞6 個(gè)細(xì)胞，卵裂球形態(tài)基本對(duì)稱且有折光性；（2）胚胎碎片比例≤20%。胚胎移植采用G-2培養(yǎng)基。所有培養(yǎng)基均添加 5%人血清白蛋白（HSA）。

五、胚胎移植

在第3天，選擇好移植的胚胎轉(zhuǎn)移至Falcon 3037培養(yǎng)皿的內(nèi)孔培養(yǎng)液（含10%HSA的G-2培養(yǎng)液）中，放入培養(yǎng)箱中待用。一般移植2個(gè)胚胎。將胚胎裝載在含25～30μl移植培養(yǎng)液的導(dǎo)管內(nèi)，兩端被兩段10 μl的氣體隔開。吸好移植液及胚胎的導(dǎo)管立即送到手術(shù)室中，待導(dǎo)管插入宮腔內(nèi)后，將胚胎與移植液（約30μl）注入宮腔內(nèi)。移植后，將導(dǎo)管送回培養(yǎng)室，反復(fù)沖洗導(dǎo)管，解剖鏡下仔細(xì)觀察是否有胚胎遺留。如果有胚胎遺留，則應(yīng)盡快通知臨床醫(yī)生，并且必須用一根干凈的移植管重新移植。所有患者于取卵當(dāng)日起予黃體酮60 mg/d 進(jìn)行黃體支持。

六、妊娠確認(rèn)

移植后常規(guī)黃體支持，14 d 測(cè)定血清β-HCG＞10 IU/L為生化妊娠， 2 周后行陰道超聲檢查， 提示宮內(nèi)有孕囊者判定為臨床妊娠，并計(jì)算種植率（種植率=孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%）。移植后3 個(gè)月 B 超隨訪有胎心搏動(dòng)者為繼續(xù)妊娠，無胎心搏動(dòng)者為早期流產(chǎn)，計(jì)算流產(chǎn)率。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13.0軟件，數(shù)據(jù)用x±s表示，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，多樣本率兩兩比較的卡方分割法，計(jì)量資料采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、3組患者女方基本情況比較

3組患者在女方年齡、不孕年限、體質(zhì)量指數(shù)、基礎(chǔ)FSH水平、基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)等方面的差異無顯著性（P均＞0.05），見表1。

二、3組患者控制性超排卵情況比較

在控制性超排卵中，3組患者促性腺激素（Gn）天數(shù)、Gn用量、HCG日雌二醇（E2）水平、HCG日子宮內(nèi)膜厚度、平均獲卵數(shù)、移植胚胎數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

三、卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)間對(duì) ICSI CSI 患者卵母細(xì)胞成熟、受精以及胚胎體外發(fā)育的影響

C組卵母細(xì)胞的成熟卵子率高于 A 組及B 組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。C組受精率高于A 組及B 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。C組優(yōu)質(zhì)胚胎率、植入率、妊娠率低于A組和B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。C組卵裂率、流產(chǎn)率與A組和B組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表1 3組患者女方基本情況比較

表2 3組患者控制性超排卵情況比較

表3 卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)間對(duì)胚胎發(fā)育以及臨床結(jié)局的影響

討 論

ICSI 是在體外顯微鏡下將單個(gè)精子直接注入成熟卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，使精、卵結(jié)合的一種顯微操作技術(shù)。該技術(shù)主要應(yīng)用于男性因素不育， 成為男性嚴(yán)重少弱精子癥、畸形精子癥及阻塞性無精子癥的有效治療方法。在輔助生殖治療過程中，注射 HCG 后 36～37 h取卵，控制性卵巢刺激（controlled ovarian stimulation，COS）人工干預(yù)措施使卵子成熟狀態(tài)不同步，取卵后何時(shí)為進(jìn)行ICSI的最佳授精時(shí)機(jī)，至今尚無共識(shí)性的標(biāo)準(zhǔn)化操作程序（SOP），不同實(shí)驗(yàn)室在授精時(shí)機(jī)操作上存在差異，普遍認(rèn)為刺激周期取卵后短時(shí)間的體外培養(yǎng)有助于卵子核和胞漿的進(jìn)一步成熟，預(yù)培養(yǎng)有助于胞漿的進(jìn)一步成熟，但卵子應(yīng)存在一個(gè)適宜的受精時(shí)機(jī)，受精時(shí)間是決定胚胎優(yōu)良與否的一個(gè)重要因素。2001年Jacobs等[2]在對(duì)881例體外受精周期獲卵后預(yù)培養(yǎng)時(shí)間與臨床結(jié)局相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞在受精前不同時(shí)間間隔的預(yù)培養(yǎng)，1～2h、2～3h、3～4h、4～5h以及大于5h受精率與胚胎質(zhì)量相近，有研究[3]認(rèn)為卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)間（4～8 h）有利于改善 ICSI 患者的臨床結(jié)局。Falcone等[4]研究發(fā)現(xiàn)ICSI之前的最適當(dāng)?shù)臏赜龝r(shí)間為5～6h。而另一些研究則認(rèn)為不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)妊娠結(jié)局無影響[2, 4]。對(duì)于卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)間對(duì) ICSI 結(jié)局的影響，各個(gè)研究的結(jié)果不盡相同。取卵后卵子培養(yǎng)時(shí)間以及授精時(shí)間在不同的實(shí)驗(yàn)室并不相同。為了探明IVF-ET中取卵后卵子培養(yǎng)時(shí)間與胚胎質(zhì)量的相關(guān)性，該文分析了3個(gè)時(shí)段授精后的相關(guān)臨床資料，旨在為臨床提供相關(guān)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

本研究從去除顆粒細(xì)胞到行 ICSI 操作總的時(shí)間是一致的，均在去除顆粒細(xì)胞1h后實(shí)施顯微注射。在本研究中，A 組及B 組在成熟卵子率、受精率、卵裂率以及優(yōu)質(zhì)胚胎率等胚胎早期發(fā)育指標(biāo)上差異并無顯著性，C組成熟卵子率高于 A 組及B 組，這可能是隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，部分MⅠ期卵子發(fā)育至MⅡ期，達(dá)到細(xì)胞核的成熟。在體外，卵母細(xì)胞質(zhì)的成熟往往遲于細(xì)胞核的成熟，盡管無法直接評(píng)估，筆者推測(cè)：一方面C 組的胞質(zhì)成熟程度可能低于A組和 B組，而細(xì)胞質(zhì)的成熟度必然與之后的胚胎發(fā)育密切相關(guān)，只有胞漿成熟的卵子內(nèi)線粒體的能量才可推動(dòng)胚胎的發(fā)育，達(dá)到卵裂球發(fā)育的同步化，成為優(yōu)質(zhì)胚胎[5, 6]，這部分卵子即使可以受精，胚胎質(zhì)量可能不佳；另一方面，卵母細(xì)胞質(zhì)量的好壞將直接影響卵細(xì)胞的受精率、受精卵的卵裂率、早期胚胎的存活、妊娠的建立和維持，高質(zhì)量卵子具有較高的受精率、卵裂率及優(yōu)質(zhì)胚胎率[7, 8]，本研究中C組隨著體外培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，本來已經(jīng)成熟的卵母細(xì)胞趨于老化，錯(cuò)過了最佳的授精時(shí)間。以上兩個(gè)方面可能是導(dǎo)致C組患者優(yōu)質(zhì)胚胎率下降的原因，胚胎質(zhì)量降低從而導(dǎo)致一系列后續(xù)影響，植入率降低、妊娠率降低。

本研究的結(jié)果顯示，卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng) 2～6 h后進(jìn)行 ICSI，卵母細(xì)胞的成熟度均維持在較理想的水平，可以獲得較為理想的臨床結(jié)局；6 h 以后雖然可以獲得更高的受精率， 但優(yōu)質(zhì)胚胎率、植入率、妊娠率有不同程度的降低， 目前，各中心所采用的促排卵方案、HCG注射時(shí)機(jī)、體外培養(yǎng)環(huán)境等因素均難以等同，這也是導(dǎo)致研究結(jié)果不盡相同的主要原因。每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都在不斷的改進(jìn)、優(yōu)化自己的SOP， 其目標(biāo)只有一個(gè)：最大限度的維持配子/胚胎固有的發(fā)育潛能，以期獲得最好的胚胎質(zhì)量和最高的妊娠率。

參 考 文 獻(xiàn)

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（2014-08-15收稿）

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.01.006

中圖分類號(hào)R 321-33

*通訊作者, E- mail: niezhaoyan@163.com

Effects of oocyte preincubation time on embryo quality and clinical outcomes after intracytoplasmic sperm injection

Nie Zhaoyan1*, Wu Haifeng2, Zhang Na1, Zhen Xiuli1, Zhang Yi1, Guo Lina1, Zhao SuYing11, The Fourth Affi liated Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011, Hebei, China;
2. Chest Hospital of Hebei Province
Corresponding author: Nie Zhaoyan, E- mail: niezhaoyan@163.com

AbstractObjective Explore the most suitable cytoplasmic sperm injection (ICSI) timing for achieving a high fertilization rate, good quality embryo rate and good outcome of pregnancy. Methodsthods According to the oocyte preincubation time (t) defi ned form the end of the time of egg retrieved to the beginning time for ICSI (T), the patients were divided into three groups including group A (2 h≤t ＜4 h, n = 174), group B (4 h≤t ＜6 h , n = 147), and group C (≥6 h, n = 82). A retrospective analysis was carried out about the effcets f the oocytes incubation time on ICSI patients fertilization rate, cleavage rate, high-quality embryo rate and clinical outcome. Resultssults (1) There were no signifi cant differences in fertilization rate (81.5% vs 83.5%), cleavage rate (98.9% vs97.5%), high-quality embryo rate (46.9% vs45.5%), implantation rate (36.7% vs32.8 %), pregnancy rate (55.2% vs551.7%) and abortion rates (12.5% v13.2%) between Group A and group B (P＞0.05). (2) Fertilization rate in Group C (88.3%) was signifi cantly higher than that in group A and group B(P＜0.05). High quality embryo rate (41.6%), implantation rate (18.7%), pregnancy rate (30.7%) in Group C were all lower obviously than those in group A and group B (P＜0.05). Cleavage rate (98.9 percent), abortion rate (12.0%) in group C had no signifi cantdifferences as compared with that of the other two groups (P＞0.05). Conclusionusion Prolonging preincubation time (≥6 h) may have a high fertility rate, and lower quality embryos, which may tamper clinical outcome of ICSI patients.

Key wordsords oocytes; in vitro; sperm injections, intracytoplasmic; embryonic development