Rho激酶信號(hào)通路與大鼠心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)系

陳 華 呂妍琨 齊 鵬 杜榮品 谷 劍 陳淑霞 耿彥平 李 燕 于 芳

(河北省人民醫(yī)院心臟中心，河北 石家莊 050051)

急性心肌梗死患者多因冠狀脈粥樣硬化起病，而后因過(guò)勞、激動(dòng)、暴飲暴食、便秘、寒熱刺激、吸煙、酗酒等導(dǎo)致斑塊破裂，進(jìn)而阻塞冠狀動(dòng)脈管腔，誘發(fā)心肌缺血、缺氧性壞死〔1〕。心肌梗死患者臨床癥狀有出汗、煩躁、惡心、嘔吐、心絞痛、休克、心力衰竭等。研究顯示，心肌缺血、缺氧性壞死是一個(gè)多種細(xì)胞因子、多途徑共同作用的結(jié)果〔2〕。Rho激酶是膠原交聯(lián)羧基末端肽(CTP)結(jié)合蛋白的重要效應(yīng)分子，可通過(guò)Rho激酶信號(hào)通路參與多種細(xì)胞的生理功能。本文擬分析Rho激酶信號(hào)通路在心肌梗死模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡組織中的表達(dá)變化及對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50只健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量245～285 g，平均(262.8±18.5)g，均購(gòu)買(mǎi)自某大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(動(dòng)物許可證編號(hào):SCX20040018);隨機(jī)選取15只作為假手術(shù)組，其余35只進(jìn)行心肌梗死造模成功后隨機(jī)分為治療組和模型組各15只(造模中死亡2只，剩余3只棄用)。均自由進(jìn)食進(jìn)水，光照時(shí)間12 h，室溫23～25℃，平均濕度(55±5)%的環(huán)境中。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與藥品 選用杭州博日生物工程有限公司生產(chǎn)的RNA抽提試劑盒、T-PCR試劑盒;選用天津紅同藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的法舒地爾;選用武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)的ABC免疫組化試劑盒、抗Bax及抗Bcl-2抗體。選用成都泰盟科技有限公司生產(chǎn)的L-420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng);選用M3 Reserch Inc PUC-IOOUM PCR擴(kuò)增儀;選用上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠生產(chǎn)的FX-DY-252型電泳儀、電熱恒溫水槽。

1.3 造模及治療方法 腹腔水合氯醛麻醉大鼠，固定于手術(shù)臺(tái)，去除胸部、頸部毛發(fā)，消毒，切開(kāi)頸部皮膚，暴露氣管及甲狀腺，于甲狀腺后方鈍性分離氣管，需注意不損傷甲狀腺及血管。剪開(kāi)氣管環(huán)，行氣管插管操作，連接呼吸機(jī)。剪開(kāi)胸部皮膚，暴露肌肉組織，分離胸大肌、前鋸肌，顯露肋骨，打開(kāi)胸膜，進(jìn)入胸腔，探查大鼠左心耳位置，于左心耳下方2 cm處進(jìn)針，縫扎左心耳及肺動(dòng)脈圓錐交接處及靜脈。觀察心電圖，如ST段抬高，同時(shí)結(jié)扎線下心肌顏色變淡，即表明造模成功。逐步縫合胸腔及頸部切口，常規(guī)抗感染治療，放回飼養(yǎng)籠。治療組大鼠行5 mg/kg胸腔法舒地爾給藥，2次/d，持續(xù)4 w。另兩組等量生理鹽水處理。

1.4 心肌梗死面積測(cè)定 4 w后腹腔麻醉大鼠，切開(kāi)大鼠頸部皮膚，暴露右側(cè)頸動(dòng)脈。游離大鼠右側(cè)頸動(dòng)脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，動(dòng)脈夾夾閉近心端，留置靜脈管，連接血壓換能器，檢測(cè)大鼠左心室收縮壓(LVSP)、左室舒張壓(LVEDP)、左室內(nèi)壓最大上升和下降速率(+dp/dtmax、-dp/dtmax)。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)方法 心肌梗死面積測(cè)定后處死大鼠，取出心臟，用生理鹽水漂洗，剪出梗死周邊區(qū)心肌組織，將其中一部分組織甲醛固定，另一部分存儲(chǔ)于－70℃溫箱內(nèi)待用。根據(jù)RNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，使用RT反應(yīng)試劑盒進(jìn)行cDNA轉(zhuǎn)錄操作，PCR擴(kuò)增，引物序列由上海生工生物工程股份有限公司提供，電泳擴(kuò)增產(chǎn)物，選用經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析樣本Rho激酶mRNA、Bax蛋白及Bcl-2蛋白表達(dá)情況。

1.6 觀察指標(biāo) 觀察4 w后的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo):LVSP、LVEDP、+dp/dtmax，-dp/dtmax;模型組和治療組心肌缺血面積、心梗面積測(cè)定值;3組心肌組織中Rho激酶mRNA、Bax及Bcl-2蛋白的表達(dá)情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 3組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)差異 模型組LVSP、+dp/dtmax、－dp/dtmax顯著低于治療組和假手術(shù)組(P＜0.05)，LVEDP顯著高于治療組和假手術(shù)組(P＜0.05)，治療組LVSP、+dp/dtmax、－dp/dtmax顯著低于假手術(shù)組(P＜0.05)，LVEDP顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較(±s，kPa，n=15)

表1 3組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較(±s，kPa，n=15)

與假手術(shù)組比較:1)P＜0.05;與治療組比較:2)P＜0.05;下表同

LVSP LVEDP +dp/dtmax -dp/dtmax假手術(shù)組 20.6±0.62 －1.26±0.32 1 102.5±230.6 －1 098.6±組別218.9模型組 15.3±0.591)2)0.36±0.611)2)683.9±172.51)2)－681.5±162.41)2)治療組 16.8±0.721) －0.64±0.421)883.5±135.41)－856.2±141.51)F值 28.253 13.698 8.624 7.182 P值 ＜0.001 0.002 0.026 0.032

2.2 治療組和模型組心肌缺血面積、心肌梗死面積百分比值治療組心肌缺血面積〔(33.6±2.8)%〕低于模型組〔(35.5±3.2)%〕，但差異不顯著(t=1.731，P=0.082);治療組心梗面積〔(29.3±2.7)%〕顯著低于模型組〔(32.6±2.9)%〕(t=3.226，P=0.004)。

2.3 3組心肌的Rho激酶mRNA、Bax蛋白、Bcl-2蛋白表達(dá)差異 3組Rho激酶mRNA、Bax蛋白、Bcl-2蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);組間均具有顯著差異(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2 3組心肌組織Rho激酶mRNA、Bax蛋白、Bcl-2蛋白表達(dá)差異(±s，n=15)

表2 3組心肌組織Rho激酶mRNA、Bax蛋白、Bcl-2蛋白表達(dá)差異(±s，n=15)

蛋白假手術(shù)組組別 Rho激酶mRNA Bax蛋白 Bcl-2 0.41±0.06 0.38±0.29 1.26±0.43治療組 0.28±0.061)2) 0.72±0.251)2) 1.74±0.411)2)模型組 0.48±0.041) 1.08±0.321) 0.63±0.381)F/P值10.742/0.002 8.288/0.026 9.690/0.018

3 討論

急性心肌梗死發(fā)病后患者將出現(xiàn)大規(guī)模的心肌細(xì)胞壞死情況，此時(shí)患者心肌功能將大幅下降，梗死及周?chē)募∈湛s乏力，心肌總收縮力降低，+dp/dtmax，-dp/dtmax下降，LVSP下降，心肌泵血能力也隨之降低，最終導(dǎo)致每搏輸出量減少，心室射血后余量降格，誘使LVEDP升高〔3〕。為保證心臟正常工作，未梗死區(qū)域心肌組織需對(duì)梗死區(qū)域進(jìn)行代償收縮，并出現(xiàn)心肌肥大、心室重構(gòu)情況。心室重構(gòu)是急性心肌梗死發(fā)病后的一種代償反應(yīng)，當(dāng)代償超過(guò)一定程度時(shí)，患者將合并心功能不全癥狀，最終發(fā)展為心力衰竭，危及生命〔4〕。本研究提示急性心肌梗死大鼠心臟收縮、舒張能力嚴(yán)重?fù)p傷，而有效的治療介入可改善大鼠心臟功能。

心肌細(xì)胞凋亡是Rho激酶、Bax蛋白等多種細(xì)胞因子共同作用結(jié)果。Rho激酶是絲氨酸/氨酸蛋白激酶，分子量為160 kD〔5〕。Rho激酶C末端區(qū)域具有激酶負(fù)性調(diào)控作用，靜息狀態(tài)下，Rho激酶C末端可通過(guò)折返或催化來(lái)抑制Rho蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)、ATP活性，并誘使下游信號(hào)無(wú)法與底物相互結(jié)合。Rho激酶具有介導(dǎo)黏著斑、整合素活性，并參與細(xì)胞生存的功能，抑制Rho激酶可損傷細(xì)胞骨架內(nèi)的肌動(dòng)蛋白絲的完整性進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞凋亡〔6〕。Rho激酶還可抑制Bcl-2活性，降低炎癥反應(yīng)，進(jìn)而降低細(xì)胞凋亡率，這表明Rho激酶可通過(guò)降低Bcl-2活性來(lái)參與細(xì)胞凋亡過(guò)程，是心血管疾病發(fā)生、發(fā)展的重要參與因子。B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)是原癌基因的一種，其可抵抗多種細(xì)胞毒素作用，增強(qiáng)DNA損傷因子的抵抗性，最終抑制細(xì)胞凋亡〔7〕。Bax基因是Bcl-2基因家族的一員，廣泛存在于肝、腎、呼吸系統(tǒng)及血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)，可與Bcl-2組成異二聚體，并抑制Bcl-2活性〔8〕。Bax蛋白是生物體重要的促細(xì)胞凋亡因子，已有研究顯示，創(chuàng)傷失血性大鼠存在明顯Bax蛋白高表達(dá)情況。Bax/Bcl-2蛋白比例是細(xì)胞凋亡抑制作用強(qiáng)弱的重要影響因子〔9〕。本研究提示法舒地爾具有抑制Rho激酶活性，調(diào)節(jié)Bcl-2蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡的作用。法舒地爾是一種具有廣泛藥理作用的新型藥劑，可通過(guò)ATP競(jìng)爭(zhēng)Rho激酶催化區(qū)的ATP位點(diǎn)，進(jìn)而抑制Rho激酶mRNA的自表達(dá)〔10〕。

綜上，Rho激酶mRNA、Bax蛋白、Bcl-2蛋白是心肌細(xì)胞凋亡的重要參與因子，其中Rho激酶mRNA、Bax蛋白具有促細(xì)胞凋亡作用，而B(niǎo)cl-2蛋白具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。而法舒地爾用藥后大鼠Rho激酶mRNA表達(dá)顯著降低，進(jìn)而降低心肌細(xì)胞凋亡率，減輕心肌梗死面積。

1 張培勇，蔡 輝，趙凌杰.Rho激酶抑制劑對(duì)壓力超負(fù)荷大鼠心肌纖維化的影響〔J〕.微循環(huán)學(xué)雜志，2013;23(1):12-5.

2 呂妍琨，陳 華，杜榮品，等.Rho激酶抑制劑對(duì)急性心肌梗死患者心肌纖維化的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2013;33(11):2651-2.

3 譚力力，李 潞，劉麗敏，等.腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)拮抗劑對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心肌縫隙連接蛋白Cx43表達(dá)的影響〔J〕.四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2013;44(4):531-5，549.

4 Wang N，Guan P，Zhang JP.Fasudil hydrochloride hydrate，a Rho-kinase inhibitor，suppresses isoproterenol-induced heart failure in rats via JNK and ERK1/2 pathways〔J〕.J Cell Biochem，2011;112(7):1920-9.

5 張培勇，沈思鈺，蔡 輝，等.法舒地爾對(duì)大鼠心肌血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2和血管緊張素(1-7)的影響〔J〕.中華老年心腦血管病雜志，2013;5(5):521-5.

6 陳偉志.內(nèi)皮祖細(xì)胞磁性標(biāo)記及MR示蹤在大鼠腦膠質(zhì)瘤血管生成研究中的應(yīng)用〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2013;33(15):3682-4.

7 Quan JX，Liu J，Gao XB.Palmitate induces interleukin-8 expression in human aortic vascular smooth muscle cells via Toll-like receptor 4/nuclear factor-κB pathway(TLR4/NF-κB-8)〔J〕.J Diabe，2014;6(1):33-41.

8 張費(fèi)通，崔其亮，莫 鏡.RhoA-Rock信號(hào)通路抑制劑對(duì)缺氧人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞絲狀肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的影響〔J〕.中國(guó)小兒急救醫(yī)學(xué)，2012;19(1):67-70.

9 王高頻，楊雪佳，史曉靜，等.阿托伐他汀抑制內(nèi)皮細(xì)胞Rho/Rho激酶信號(hào)通路改善細(xì)胞骨架〔J〕.中華老年心腦血管病雜志，2012;14(7):752-5.

10 馬東蔚，王秋月，馬小羽，等.法舒地爾通過(guò)Rho/ROCK信號(hào)通路對(duì)高糖培養(yǎng)人腎小球系膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)及纖維化的影響〔J〕.中華內(nèi)科雜志，2011;50(7):580-4.