mir-134/Pum2信號通路在匹羅卡品致顛癇大鼠腦組織中的表達(dá)及作用

吳旭玲 陳陽美 (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶 400010)

研究顯示難治性癲癇的發(fā)生與腦內(nèi)神經(jīng)元形成的異常網(wǎng)絡(luò)連接緊密相關(guān)〔1〕，而神經(jīng)元樹突和軸突的異常芽生會導(dǎo)致突觸重組使神經(jīng)元之間形成異常的興奮性網(wǎng)絡(luò)連接〔2〕。已經(jīng)有研究顯示多種miRNA與癲癇的發(fā)病機(jī)制相關(guān)〔3〕，其中mir-134可以調(diào)控樹突棘的形態(tài)參與癲癇的發(fā)生〔4〕，而Pumilio2(Pum2)的下調(diào)則是mir-134促進(jìn)樹突生長的必要環(huán)節(jié)〔5〕。有研究表明Pum2與神經(jīng)元樹突的生長和分支有關(guān)，在突觸重組中發(fā)揮重要作用〔6〕;另外，Pum2還可以在翻譯水平調(diào)控電壓門控鈉離子通道(Nav)的表達(dá)，參與神經(jīng)元興奮性的調(diào)節(jié)〔7〕。這些都提示Pum2可能與癲癇的發(fā)生存在著某種關(guān)系。本研究擬驗(yàn)證mir-134和Pum2在癲癇大鼠模型中的表達(dá)情況并對Pum2的表達(dá)進(jìn)行定位。

1 材料與方法

1.1 癲癇模型建立 所有動物實(shí)驗(yàn)程序符合國際倫理準(zhǔn)則，并得到了重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會的同意。選取體重180～220 g的成年雄性S-D大鼠42只，均來自于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境條件下(溫度:20℃，濕度:50%～60%)，大鼠被隨機(jī)分為7組，分別為生理鹽水對照組大鼠、癲癇大發(fā)作后 1、3、7、14、30、60 d 大鼠。腹腔注射氯化鋰(127 mg/kg，美國 Sigma公司)18～24 h后給予匹羅卡品(35 mg/kg，美國Sigma公司)腹腔注射，應(yīng)用匹羅卡品前30 min腹腔注射硫酸阿托品1 mg/kg以減輕匹羅卡品的外周膽堿能效應(yīng)。30 min后若無 Racine分級〔8〕Ⅳ級以上發(fā)作，則每隔10 min追加一次匹羅卡品(10 mg/kg)，直到達(dá)到以上級別，每只大鼠的追加總量不超過50 mg/kg，達(dá)到Ⅳ級以上發(fā)作的大鼠在癲癇持續(xù)狀態(tài)1 h后給予地西泮10 mg/kg終止發(fā)作。

1.2 組織處理 10%水合氯醛3 ml/kg充分麻醉大鼠，斷頭后取出大腦，迅速剝離出海馬組織放于液氮中，隨后儲存于－80℃，用于蛋白和RNA的提取。剩余部分大鼠在麻醉后用生理鹽水和4%多聚甲醛灌注，隨后取出大腦固定于4%多聚甲醛中24 h，切成10 μm厚的冰凍切片用于免疫熒光檢測。

1.3 熒光定量PCR 用RNAiso plus試劑(TaKaRa公司)提取大鼠腦組織中的總RNA，提取流程按操作說明書進(jìn)行，提取好的總RNA的濃度和純度用波長260/280 nm檢測，當(dāng)A260/A280比值1.8～2.2時RNA可用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。用TaKaRa的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒根據(jù)其說明步驟得到互補(bǔ)的cDNA，擴(kuò)增反應(yīng)在Bio-Rad CFX96實(shí)時PCR檢測系統(tǒng)中進(jìn)行，用u6小RNA作為內(nèi)參。PCR反應(yīng)體系包括:去離子水3.2 μl，SYRB Green熒光染料(TaKaRa 公司)5 μl，上下游引物各 0.4 μl和 cDNA 1 μl。反應(yīng)條件為:①95℃，30 s;②95℃，5 s;③60℃，30 s;④第2～3步循環(huán)39次，⑤65℃升至95℃行溶解曲線分析(升溫速率0.5℃ /次，5 s)。

1.4 蛋白免疫印跡檢測 用總蛋白提取試劑盒(凱基)提取大鼠腦組織中的蛋白，用增強(qiáng)BCA試劑(碧云天)測定蛋白濃度。從蛋白樣品中取50 μg總蛋白于8%SDS-PAGE上電泳，并電轉(zhuǎn)到PVDF膜上。在室溫條件下用5%BSA孵育PVDF纖維膜1.5 h，然后用兔多克隆一抗 Pum2(1∶5 000，GeneTex)和 β-actin(1∶1 000，Santa Cruz)孵育PVDF膜4℃過夜;次日，室溫下孵育PVDF膜于辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶5 000，杉金橋)中2 h。最后在暗室中用ECL試劑(Pierce公司)對蛋白條帶進(jìn)行顯影。用Quantity One 4.6.2軟件分析Pum2的相對含量，β-actin作為內(nèi)參。

1.5 雙標(biāo)免疫熒光 冰凍切片于室溫下自然晾干后用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗5 min，將切片浸泡于0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0)在微波爐中高火煮沸5 min再調(diào)至低火15 min，隨后取出于室溫下自然冷卻。0.04%Triton X-100(Sigma)37℃孵育15 min后再用正常山羊血清(中杉金橋)37℃封閉30 min，甩掉多余血清，滴加配好的混合一抗4℃過夜?；旌弦豢篂橥每勾笫驪um2抗體(1∶50，GeneTex)分別與以下三種物質(zhì)的混合:小鼠抗大鼠MAP2抗體(1∶50，Abcam)、小鼠抗大鼠GFAP 抗體(1∶300，CST)和碘化丙啶(100 μg/ml，Sigma)。第二天，37℃復(fù)溫1 h后充分沖洗一抗，滴加FITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶100，中杉金橋)和TRITC標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗(1∶100，中杉金橋)混合抗體于37℃下避光孵育1 h，最后充分沖洗二抗用50%甘油封片。

1.6 圖像采集和統(tǒng)計學(xué)分析 用激光掃描共聚焦顯微鏡對雙標(biāo)免疫熒光結(jié)果進(jìn)行圖像采集。數(shù)據(jù)用±s表示，采用SPSS 20.0軟件行LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 mir-134在大鼠癲癇模型中各時間點(diǎn)的表達(dá)變化 與對照組(0.53±0.06)大鼠相比，癲癇大發(fā)作后mir-134的表達(dá)變化有波動性:急性期(1 d和3 d)的大鼠mir-134表達(dá)(1.13±0.17、1.70±0.14)顯著升高(P＜0.05);在隨后的潛伏期(7 d和14 d)mir-134水平(0.66±0.08、0.73±0.12)有所下降，但仍高于對照組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);慢性期(30 d和60 d)，mir-134的表達(dá)(0.157±0.16、1.67±0.10)又明顯上調(diào)(P＜0.05)且居于一個相對穩(wěn)定的水平。

2.2 Pum2蛋白在癲癇大鼠海馬及鄰近皮質(zhì)中的表達(dá)變化情況 在點(diǎn)燃后的急性期1 d(0.47±0.13)和3 d(0.47±0.09)，Pum2的表達(dá)水平就明顯低于對照組(0.78±0.12)(P＜0.05)，第7天(0.56±0.08)Pum2的表達(dá)水平較急性期有所升高，但仍顯著低于對照組(P＜0.05);在隨后的14 d(0.43±0.13)、30 d(0.30±0.07)和60 d(0.28±0.03)，Pum2的表達(dá)又趨于下降，均低于對照組(P＜0.05)，在慢性期達(dá)到最低水平。見圖1。

圖1 各組Pum2的蛋白免疫印跡結(jié)果

2.3 雙標(biāo)免疫熒光 用雙標(biāo)免疫熒光對Pum2蛋白的表達(dá)進(jìn)行定位，Pum2(綠色信號)與神經(jīng)元標(biāo)志物MAP2(紅色信號)的表達(dá)位置重合，而與星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP(紅色信號)和細(xì)胞核標(biāo)記物PI(紅色信號)均不重合，見圖2，說明Pum2在腦內(nèi)表達(dá)于神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)和樹突中。

圖2 雙標(biāo)免疫熒光檢測Pum2在細(xì)胞中的定位

3 討論

腦內(nèi)廣泛性興奮性環(huán)路的形成是癲癇形成的主要神經(jīng)病理學(xué)改變，異常的樹突生長和突觸重組會導(dǎo)致神經(jīng)元之間的異常聯(lián)系促進(jìn)神經(jīng)環(huán)路的建立。Fiore等〔5〕已經(jīng)在體外實(shí)驗(yàn)中證明活性依賴的mir-134可以通過對Pum2的調(diào)控促進(jìn)樹突的生長。但mir-134/Pum2信號通路是否參與了癲癇的發(fā)病機(jī)制還不夠明確，介于氯化鋰-匹羅卡品模型是研究人類顳葉難治性癲癇病理生理機(jī)制極具代表性的工具〔9〕，所以本實(shí)驗(yàn)在匹羅卡品癲癇大鼠模型中對mir-134和Pum2的表達(dá)進(jìn)行了研究。

miRNA在翻譯水平對蛋白合成進(jìn)行調(diào)控，研究顯示腦內(nèi)某些miRNA與突觸重組緊密相關(guān)。樹突棘是存在于樹突表明的細(xì)小突起，為主要的興奮性突觸的突出后成分，其動態(tài)變化是突觸重組的重要形式。mir-134是一種腦特異性的miRNA，表達(dá)于神經(jīng)元樹突上并能負(fù)性調(diào)控樹突棘的大小〔10〕。這一作用是通過抑制LIM區(qū)域激酶(Limk)1的mRNA翻譯介導(dǎo)的，Limk1可以磷酸化絲切蛋白(cofilin)并使其失去剪切活性從而改變神經(jīng)元突起的形態(tài)。Jimenez-Mateos等〔11〕發(fā)現(xiàn)沉默mir-134可以使小鼠海馬CA3區(qū)樹突棘密度降低，并且具有神經(jīng)保護(hù)功能，有效抑制癲癇的發(fā)作。本研究用熒光定量 PCR測定癲癇大鼠海馬內(nèi)的mir-134表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)在點(diǎn)燃后的急性期mir-134就有顯著升高，潛伏期降至接近正常水平，當(dāng)進(jìn)行到自發(fā)性癲癇的慢性期時mir-134的表達(dá)又回升到一個高水平狀態(tài)。這一變化趨勢與Peng等〔12〕在幼鼠中的研究相一致，而非難治性癲癇中mir-134表達(dá)卻無變化。由此我們肯定mir-134參與了難治性癲癇的發(fā)生發(fā)展過程。

已有研究證明，Pum2 mRNA是mir-134的靶向基因，活性誘導(dǎo)的mir-134高表達(dá)能抑制Pum2的表達(dá)，促進(jìn)樹突的生長，但在誘導(dǎo)mir-134表達(dá)的同時再過表達(dá)Pum2時，這種促進(jìn)樹突生長的易化作用便不能表現(xiàn)出來，說明mir-134促進(jìn)樹突生長是通過負(fù)性調(diào)控Pum2起作用的。所以我們對癲癇模型中Pum2的表達(dá)也進(jìn)行了研究，雙標(biāo)免疫熒光結(jié)果顯示Pum2位于神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)和樹突上，這與mir-134的表達(dá)部位相接近，并且蛋白免疫印跡表明在癲癇模型中Pum2的表達(dá)均較對照組低，與mir-134表達(dá)趨勢相反，這一變化可能是由于mir-134表達(dá)升高對Pum2的抑制作用增強(qiáng)所致。Pum2的C末端有8個α螺旋重復(fù)序列串聯(lián)構(gòu)成的高度保守的PUM-HD，可以與特異性的單鏈RNA(即mRNA)結(jié)合，抑制翻譯功能的進(jìn)行，負(fù)性調(diào)控靶基因的表達(dá)。目前已經(jīng)有大量研究表明Pum2對樹突的生長具有負(fù)性調(diào)控作用〔6，13〕。在體外干擾了Pum2表達(dá)的海馬神經(jīng)元中觀察到樹突的生長、分支復(fù)雜度以及樹突上興奮性突觸的數(shù)量均高于對照組，而過表達(dá)Pum2則會觀察到相反的結(jié)果。除此之外，Pum2還能與許多mRNA結(jié)合，抑制其他蛋白的表達(dá)，其中一些與癲癇的發(fā)生密切相關(guān)。比如Pum2可以與細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶2(Erk2)和p38α mRNA的3'UTR結(jié)合，對絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路進(jìn)行調(diào)控〔14〕。MAPK是一族可以激活其他細(xì)胞因子的蛋白激酶，其活化在癲癇神經(jīng)元死亡及反應(yīng)性增生中都發(fā)揮了積極的作用。還有大量研究顯示Pum2可以調(diào)控NaV的表達(dá)，通過對動作電位的影響改變神經(jīng)元的興奮性，當(dāng)神經(jīng)的元過度興奮放電就會導(dǎo)致癲癇的發(fā)生。一方面Pum2結(jié)合到神經(jīng)元具有興奮性的NaV1.6 mRNA上〔15〕，抑制NaV1.6的表達(dá)對神經(jīng)元的興奮性發(fā)揮直接調(diào)控作用;另一方面Pum2也可以通過對活化的蛋白激酶C受體1(RACK1)的負(fù)性調(diào)節(jié)在神經(jīng)元興奮性調(diào)節(jié)中發(fā)揮間接作用〔16〕。RACK1使海馬GABA能中間神經(jīng)元上的Nav1.1表達(dá)降低〔17〕，發(fā)放的抑制性沖動相對減少，神經(jīng)元興奮性升高。所以，當(dāng)Pum2表達(dá)下降時腦內(nèi)神經(jīng)興奮性升高是促進(jìn)癲癇發(fā)生的重要因素。

綜上所述，根據(jù)本文結(jié)果可以推測mir-134/Pum2通路參與了難治性癲癇的形成過程，為進(jìn)一步的機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。雖然mir-134與Pum2的變化趨勢相符，提示mir-134通過Pum2而發(fā)生作用參與到癲癇的發(fā)展，但是mir-134可以不只作用于Pum2一個靶點(diǎn)，Pum2也不只是受到mir-134的調(diào)控，多種分子都可以影響突觸重組，所以，我們研究的只是一種現(xiàn)象的變化，不能除外其他影響因素的作用。

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