載脂蛋白Eε4基因型預(yù)測(cè)老年缺血性腦血管病復(fù)發(fā)的意義

李國(guó)輝 (梧州市紅十字會(huì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西 梧州 543002)

缺血性腦血管病(ICVD)已經(jīng)成為引起老年死亡和癱瘓的最主要原因之一〔1〕，傳統(tǒng)的危險(xiǎn)因素如高血壓、糖尿病，吸煙，高膽固醇血癥以及心臟病等均與缺血性腦血管病的發(fā)病率和復(fù)發(fā)有關(guān)。但最新的研究認(rèn)為ICVD病情復(fù)雜，病因多，不僅受傳統(tǒng)的危險(xiǎn)因素的影響，還受遺傳因素的影響〔2〕?；蚩梢灾苯佑绊懩X卒中的發(fā)生血管危險(xiǎn)因素和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。已有文獻(xiàn)表明〔3〕，在心肌梗死的患者中存在幾個(gè)潛在的基因多態(tài)性，但這些基因多態(tài)性是否與腦卒中有關(guān)目前尚未見報(bào)道。載脂蛋白E(APOE)的基因多態(tài)性是影響血漿脂蛋白的重要調(diào)節(jié)因素，也是阿爾茨海默病(AD)的一個(gè)危險(xiǎn)因素。載脂蛋白E基因位于19號(hào)染色體上，常見有3種多態(tài)性E2，E3和E4，分別編碼血漿中的載脂蛋白E(apoE)異構(gòu)體。載脂蛋白E影響肝臟對(duì)脂蛋白的結(jié)合、吸收和分解代謝，并與血清脂蛋白水平相關(guān)。研究證明〔4〕APOE基因多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化有明顯的關(guān)系。臨床研究表明〔5〕，APOEε4等位基因與中國(guó)人群的心肌梗死和冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生也有密切的聯(lián)系，但它與ICVD的關(guān)系至今尚未有定論，結(jié)果也多是相互矛盾的。國(guó)外有人認(rèn)為〔6〕，APOEε2與 ICVD 有關(guān)，載脂蛋白 Eε4不僅與ICVD有關(guān)，還與粥樣硬化的發(fā)生有關(guān)，但也有人認(rèn)為APO的基因型與腦梗死沒有明顯的相關(guān)性。為探討APOEε4單體型對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響及其在誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化中的可能性作用，本研究評(píng)估了APOEε4單體型與ICVD復(fù)發(fā)的關(guān)系，旨在尋找一個(gè)可以用來(lái)預(yù)測(cè)中國(guó)人群發(fā)生ICVD的特定的APOE基因單體型。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 2010年6月至2012年12月在梧州市紅十字會(huì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科診斷并接受治療的ICVD患者248例，在隨訪結(jié)束時(shí)幸存者215例，其中男121例，女94例，年齡43～87歲〔平均(64.73±13.21)〕歲。所有患者均接受神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師對(duì)其進(jìn)行常規(guī)臨床評(píng)估，包括病史詢問和體格檢查，同時(shí)還進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室檢查、胸片、超聲心電圖和磁共振成像(MRI)檢查。排除疑似老年癡呆癥(即在發(fā)生ICVD之前，記憶、語(yǔ)言和其他認(rèn)知功能已逐步下降)和有出血性腦卒中病史的患者。本研究在醫(yī)院倫理委員會(huì)的同意下進(jìn)行。

1.2 ICVD的診斷標(biāo)準(zhǔn)及分類 當(dāng)患者出現(xiàn)漸進(jìn)性的或偶爾快速發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀持續(xù)24 h以上，并經(jīng)CT或MRI檢測(cè)到的相應(yīng)的腦缺血性改變，可診斷為ICVD。其中明顯的腦卒中或短暫性腦缺血發(fā)作患者排除在外。根據(jù)磁共振血管造影(MRA)、常規(guī)血管造影、頸動(dòng)脈多普勒超聲檢查、心電圖和超聲心動(dòng)圖結(jié)果確認(rèn)腦卒中的亞型。

1.3 腦卒中危險(xiǎn)因素評(píng)估 臨床資料包括年齡、性別、高血壓史(即入院前已服用降壓藥，或在出現(xiàn)缺血性腦血管病指征1個(gè)月內(nèi)多次測(cè)量血壓，均為收縮壓＞160 mmHg或舒張壓＞95 mmHg)，糖尿病(即空腹血糖水平＞140 mg/dl或有糖尿病治療史)，高脂血癥(即在入選時(shí)的總膽固醇水平＞220 mg/dl，甘油三酯水平＞150 mg/dl，或高密度脂蛋白＜40 mg/dl，或有高脂血癥治療史)，吸煙習(xí)慣(分為當(dāng)前吸煙者，戒煙者，或不吸煙)，ICVD家族史或ICVD前兆(即在ICVD指征出現(xiàn)前已出現(xiàn)的可通過神經(jīng)影像學(xué)證明其存在的臨床癥狀)和心臟病(已知心臟病史或有心臟病臨床指征，包括心肌梗死、心絞痛、充血性心臟衰竭或心律不齊等)。

1.4 隨訪 患者治療出院后每3個(gè)月復(fù)查1次，隨訪時(shí)間至2013年6月。詢問患者和(或)護(hù)理人員是否有出現(xiàn)腦卒中癥狀或其他新的神經(jīng)癥狀。通過審查相關(guān)的醫(yī)療記錄和神經(jīng)影像學(xué)資料(CT或MRI結(jié)果)確認(rèn)患者是否復(fù)發(fā)ICVD。在隨訪期間，有33例患者病故或失訪，故這些患者最后也被排除在外。其余215例存活病人繼續(xù)接受體檢，并根據(jù)腦卒中亞型進(jìn)行藥物治療，以預(yù)防ICVD復(fù)發(fā)。

1.5 APOE基因分型 APOE基因分型采用PCR－RFLP法進(jìn)行。受試者常規(guī)禁食12 h后，于次日6:00～7:00采外周靜脈血4 ml，采用檸檬酸鈉抗凝，利用常規(guī)酚/氯仿抽提法提取基因組DNA。APOE基因特異性引物采用文獻(xiàn)報(bào)道〔7〕中現(xiàn)成的序列，上游為 5’－TCC AAG GAG CTG CAG GCG GCG CA－3’，下游為 5’－ACA GAA TTC GCC CCG GCC TGG TAC ACT GCC A3’。PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性 5 min，65℃退火 30 s，70℃延伸90 s，40個(gè)循環(huán)，再繼續(xù)70℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為227 bp，涵蓋APOE所有的多態(tài)性位點(diǎn)。取20 μl PCR產(chǎn)物，加入對(duì)APOEε4基因特異的HhaI內(nèi)切酶10 U，在37℃進(jìn)行限制性酶切反應(yīng)5 h。酶切產(chǎn)物在15%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳5 h，恒流60 mA。電泳完畢，凝膠經(jīng)EB染色后于ChampGel 3200圖像采集系統(tǒng)(北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司)中進(jìn)行掃描分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS13.0軟件。采用Kaplan－Meier乘積極限法估計(jì)各組中ICVD復(fù)發(fā)的累積比例，多變量分析采用COX危險(xiǎn)比分析法。計(jì)數(shù)資料組間對(duì)比采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床資料比較 本研究215例ICVD存活者中有APOEε4基因陽(yáng)性者38例(17.7%)。以 APOEε4基因進(jìn)行分組，可分為APOEε4基因陽(yáng)性組和APOEε4基因陰性組〔177例(82.3%)〕。對(duì)兩組患者的臨床資料進(jìn)行比較時(shí)發(fā)現(xiàn)，APOEε4基因陽(yáng)性組患者出現(xiàn)腦卒中前兆的比例為78.9%，明顯高于APOEε4基因陰性組患者(35.0%，P＜0.01)，而其他臨床資料，包括年齡、性別、高血壓、糖尿病、高脂血癥、吸煙習(xí)慣、腦卒中家族史及心臟病等，在兩組間則不存在顯著差異(見表1)。

表1 ICVD患者的臨床資料〔n(%)〕

2.2 腦卒中亞型在APOEε4基因陽(yáng)性或陰性組中的分布 分別對(duì)兩組患者的腦卒中亞型進(jìn)行分類，腦卒中亞型在APOEε4基因陽(yáng)性或陰性組中的分布無(wú)顯著差異(P＞0.05)。見表2。

2.3 APOEε4單體型與ICVD復(fù)發(fā)的關(guān)系 在隨訪期間，有48例患者癥狀復(fù)發(fā)，采用Kaplan－Meier法估算出3年的累積復(fù)發(fā)率為22.3%。通過COX危險(xiǎn)比回歸模型分析ICVD的預(yù)后因素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，心臟病是ICVD復(fù)發(fā)的一個(gè)危險(xiǎn)因素(危險(xiǎn)比3.04，95%CI=1.23～7.51，P=0.2)，ICVD 前兆對(duì) ICVD 是否復(fù)發(fā)有影響，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(危險(xiǎn)比1.59，95%CI=0.58～4.31，P=0.6)。APOEε4基因也是ICVD復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的一個(gè)重要的預(yù)測(cè)因子(危險(xiǎn)比為 4.11，95%CI:1.49～11.32，P＜0.001)。38例攜帶APOEε4基因單體型的ICVD患者中有20例復(fù)發(fā)，發(fā)生率為52.6%，而177例不攜帶APOEε4基因單體型的ICVD患者中有28例復(fù)發(fā)，其發(fā)生率僅為15.8%。

表2 腦卒中亞型在APOEε4基因陽(yáng)性或陰性組中的分布〔n(%)〕

3 討論

ε4等位基因在冠狀動(dòng)脈心臟疾病和ICVD中的作用機(jī)制目前尚不清楚。有學(xué)者認(rèn)為〔8〕，APOE基因多態(tài)性會(huì)導(dǎo)致脂蛋白代謝發(fā)生異常，而ε4等位基因可能會(huì)導(dǎo)致低密度脂蛋白的產(chǎn)量增加及其在外周血中的分解代謝降低。APOE基因在動(dòng)脈粥樣硬化形成過程中的作用已被多個(gè)研究證明，如Cao等〔9〕發(fā)現(xiàn)，APOE缺陷小鼠會(huì)發(fā)生血脂異常及動(dòng)脈粥樣硬化性病變，而將APOE基因?qū)氲紸POE缺陷小鼠中，則會(huì)使血脂水平恢復(fù)正常，飲食誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化也會(huì)得到緩解，已存在的斑塊會(huì)逐漸減小。但是，APOEε4等位基因與冠心病的關(guān)系在調(diào)整了低密度脂蛋白膽固醇水平之后仍然會(huì)存在，而這種現(xiàn)象同樣存在于頸動(dòng)脈粥樣硬化中，由此表明，APOEε4等位基因與脂蛋白水平并沒有直接的聯(lián)系。APOE等位基因特異的抗氧化活性可能是由 ε4等位基因引起的。另有研究發(fā)現(xiàn)〔10，11〕，將人的APOEε3和ε4基因分別導(dǎo)入到APOE缺失的裸鼠體內(nèi)，ε4轉(zhuǎn)基因小鼠比ε3轉(zhuǎn)基因小鼠更容易發(fā)生大腦損傷，原因可能是APOEε3基因具有保護(hù)性作用，而ε4基因則起到致病性作用。

近年來(lái)，人們逐漸發(fā)現(xiàn)APOEε4基因多態(tài)性與中國(guó)漢族人群中的阿爾茨海默氏病患者的認(rèn)知障礙有密切的聯(lián)系〔12～14〕，但其與復(fù)發(fā)型ICVD的關(guān)系尚未見有研究報(bào)道。本研究經(jīng)多因素分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除心臟病是ICVD復(fù)發(fā)的一個(gè)危險(xiǎn)因素之外，APOEε4基因也是ICVD復(fù)發(fā)的一個(gè)重要風(fēng)險(xiǎn)因素。以前的研究結(jié)果表明〔15〕，傳統(tǒng)的心血管危險(xiǎn)因素，如男性、吸煙、高血壓、糖尿病及高脂血癥等均能預(yù)測(cè)心血管疾病和腦血管疾病，但在本研究中，這些因素與ICVD復(fù)發(fā)并無(wú)顯著關(guān)系，這可能與樣本量太小有關(guān)。本研究主要探討APOEε4基因與ICVD復(fù)發(fā)的關(guān)系而不是與ICVD發(fā)病的關(guān)系，所以本組研究對(duì)象未包含正常人群。因?yàn)橐延械难芯孔C明，ICVD患者中的APOEε4基因陽(yáng)性率與正常人群之間差異并不明顯〔7〕。

本研究發(fā)現(xiàn)APOEε4基因型與ICVD的復(fù)發(fā)有明顯的相關(guān)性，可以作為一個(gè)評(píng)估ICVD患者預(yù)后尤其是復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的一個(gè)預(yù)測(cè)因素。同時(shí)，本研究結(jié)果還可以用于篩查具有高危復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的ICVD患者，通過及早采取適當(dāng)?shù)念A(yù)防措施有效避免ICVD的復(fù)發(fā)。

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