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    小麥抗凍基因sod的克隆及表達(dá)分析

    2015-08-02 01:03:36王方平趙維萍
    滁州學(xué)院學(xué)報(bào) 2015年2期
    關(guān)鍵詞:淮麥春性鄭麥

    蔡 華,王方平,余 意,趙維萍

    小麥?zhǔn)俏覈?guó)主要糧食作物,近年種植面積逐漸擴(kuò)大。但部分小麥品種的抗凍性較差,加上某些人為與自然因素(如搶墑、早播等),以及冬春季災(zāi)害性天氣頻繁出現(xiàn),低溫凍害對(duì)小麥生產(chǎn)的影響越來(lái)越大,已成為影響小麥生產(chǎn)最主要的災(zāi)害之一[1]。

    抗凍基因是一種誘發(fā)基因,只有在特定條件(主要是低溫和短日照)的作用下,才能啟動(dòng)其表達(dá)[2]。在抗凍基因表達(dá)前,植物的抗凍能力僅僅是一種潛能或基礎(chǔ)[3]。近年來(lái),隨著對(duì)植物抗凍機(jī)理研究的不斷深入,以及分子生物學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用于作物抗凍性研究,利用基因克隆技術(shù)提高作物的抗凍性也取得了突破性進(jìn)展[4]。在植物的凍害機(jī)理研究上,許多研究表明超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)、抗壞血酸過(guò)氧化酶(ascorbate peroxidase,APX)、谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase,GR)等酶活性的高低與植物抗凍性密切相關(guān)[5-10],其中,SOD被普遍認(rèn)為是一類重要的抗凍因子。SOD是一種十分重要的生物體防止氧化損傷的酶類,是生物體內(nèi)超氧陰離子的清除劑。低溫條件下,細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除平衡遭到破壞,膜系統(tǒng)穩(wěn)定性受到影響,活性氧積累,使膜脂發(fā)生過(guò)氧化和脫脂作用,從而破壞膜結(jié)構(gòu),而SOD可清除活性氧,維護(hù)膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性[11]。此外,SOD在植物抗低溫、干旱等逆境方面也有重要作用[12-15]。國(guó)內(nèi)有關(guān)小麥 SOD的研究,大多集中于生產(chǎn)應(yīng)用[16]。本研究選取安徽省近年推廣的生態(tài)類型不同的8個(gè)小麥品種,抽穗前在實(shí)驗(yàn)室模擬自然凍害條件進(jìn)行脅迫處理,提取其總RNA,反轉(zhuǎn)錄后克隆sod基因,再進(jìn)行半定量研究,分析不同生態(tài)類型小麥品種sod基因表達(dá)狀況,并與未經(jīng)凍害脅迫處理的小麥進(jìn)行比較,分析sod基因?qū)π←溈箖龅淖饔?,并為小麥抗凍機(jī)理研究提供理論依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    試驗(yàn)選用煙農(nóng)19、濟(jì)麥22、淮麥30、皖農(nóng)墾2號(hào)、中國(guó)春、揚(yáng)麥15、煤生P2-1和鄭麥9023等8個(gè)安徽省推廣小麥品種,精選后于10月下旬播于裝有表土施足基肥的盆缽中,每盆10株,連盆埋于滁州學(xué)院小麥試驗(yàn)基地,盆口與地面平齊,其他田間管理參照大田,試驗(yàn)材料田間生長(zhǎng)情況見圖1。

    圖1 小麥田間盆栽

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 低溫脅迫處理

    于次年3月份,從田間連盆挖出已拔節(jié)的小麥苗,分成實(shí)驗(yàn)和對(duì)照兩組,放入恒溫培養(yǎng)箱處理。實(shí)驗(yàn)組先后設(shè)置如下處理:25℃處理24h,10℃處理12h;5℃處理12h;-1℃處理24h。期間按白天給光,夜間不給光。在-1℃處理期間,間隔6小時(shí)左右觀察一次,如發(fā)現(xiàn)有明顯葉片凍壞,即剪尚未凍傷的余葉,放入-80℃或液氮保存,留待抽提RNA用。對(duì)照組一直放在25℃處理72h。兩組小麥處理完成后,均剪取適量的葉片放入超低溫冰箱保存,留待抽提RNA用。

    1.2.2 sod基因的克隆

    取0.5g葉片樣品置于液氮中,研磨至粉末狀,用RNAiso Plus(TaKaRa公司)提取總RNA,并參照TIANScript RT Kit(TIANGEN 公司)操作步驟合成cDNA;根據(jù)GenBank中已有sod序列(AF092524),利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)克隆小麥sod基因的引物SOD(表1)。再以上述cDNA為模板,以上述SOD引物為引物,配制10μL PCR體系,選取同上的PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增片段利用AXYGEN生物技術(shù)(杭州)有限公司提供的AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收純化。將純化后的目的DNA樣品連接到TaKaRa公司提供的pMDTM18-T上,TA克隆后送往英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測(cè)序鑒定。

    表1 擴(kuò)增抗凍基因及內(nèi)參基因所用的引物

    1.2.3 sod基因表達(dá)水平的檢測(cè)

    用Tubulin(小麥微管蛋白)基因作為內(nèi)參,以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物單鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,使不同的樣品所擴(kuò)增Tubulin的電泳條帶亮度一致,進(jìn)一步確定所需單鏈cDNA的模板量,然后進(jìn)行各樣品的sod基因的半定量實(shí)驗(yàn)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同品種小麥對(duì)凍害處理的反應(yīng)

    凍害脅迫處理完全后,對(duì)本試驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)室中模擬自然變溫處理的8個(gè)不同小麥品種進(jìn)行受凍情況調(diào)查,結(jié)果發(fā)現(xiàn),同一時(shí)期播種的相同時(shí)間進(jìn)行凍害處理的8個(gè)不同小麥品種中,揚(yáng)麥15凍死株高達(dá)12株,鄭麥9023凍死株10株,中國(guó)春凍死株9株,淮麥30凍死株有10株,濟(jì)麥22凍死株3株,煤生P2-1凍死株和5株,皖農(nóng)墾凍死株有3株,而煙農(nóng)19未觀察到凍死株,僅葉尖受凍枯死(見表2)。這恰好與小麥的春化類型基本相關(guān),小麥春化類型分為春性、弱春性、半冬性、冬性小麥。在本實(shí)驗(yàn)中,春性小麥有揚(yáng)麥15;弱春性小麥有鄭麥9023、淮麥30和中國(guó)春;半冬性小麥有濟(jì)麥22、煤生P2-1和皖農(nóng)墾2號(hào);冬性小麥有煙農(nóng)19。

    表2 8個(gè)不同品種小麥凍害處理后幼穗凍死狀態(tài)及凍害程度

    2.2 sod基因cDNA片段的克隆

    提取小麥的總RNA凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。

    (1、2、3、4、5、6、7、8分別為實(shí)驗(yàn)組煙農(nóng)19、濟(jì)麥22、淮麥30、皖農(nóng)墾2號(hào)、中國(guó)春、揚(yáng)麥15、煤生P2-1、鄭麥9023小麥葉片 RNA 條帶,a、b、c、d、e、f、g、h分別為對(duì)照組煙農(nóng)19、濟(jì)麥22、淮麥30、皖農(nóng)墾2號(hào)、中國(guó)春、揚(yáng)麥15、煤生P2-1、鄭麥9023小麥葉片RNA條帶,M為Trans 2KMarker)

    利用表1中SOD引物,從小麥葉片內(nèi)擴(kuò)增到預(yù)期的sod基因cDNA片段(見圖2)。

    圖2 小麥葉片RNA提取凝膠電泳結(jié)果圖

    圖3 SOD引物PCR凝膠電泳結(jié)果圖

    (1、2、3、4、5、6、7、8分別為實(shí)驗(yàn)組煙農(nóng)19、濟(jì)麥22、淮麥30、皖農(nóng)墾2號(hào)、中國(guó)春、揚(yáng)麥15、煤生P2-1、鄭麥9023樣品cDNA用SOD引物PCR凝膠電泳條帶,a、b、c、d、e、f、g、h分別為對(duì)照組煙農(nóng)19、濟(jì)麥22、淮麥30、皖農(nóng)墾2號(hào)、中國(guó)春、揚(yáng)麥15、煤生P2-1、鄭麥9023樣品cDNA用SOD引物PCR凝膠電泳條帶,M為Trans 2KMarker)

    測(cè)序后經(jīng)同源性比較顯示,擴(kuò)增的片段與已報(bào)道相關(guān)基因同源性均在90%以上,表明擴(kuò)增的片段準(zhǔn)確無(wú)誤,可用于以下半定量PCR比較試驗(yàn)。

    2.3 凍害處理前后sod基因的轉(zhuǎn)錄水平的變化

    (1、2、3、4、5、6、7、8分別為實(shí)驗(yàn)組煙農(nóng)19、濟(jì)麥22、淮麥30、皖農(nóng)墾2號(hào)、中國(guó)春、揚(yáng)麥15、煤生P2-1、鄭麥9023樣品cDNA用SOD引物PCR凝膠電泳條帶,a、b、c、d、e、f、g、h分別為對(duì)照組煙農(nóng)19、濟(jì)麥22、淮麥30、皖農(nóng)墾2號(hào)、中國(guó)春、揚(yáng)麥15、煤生P2-1、鄭麥9023樣品cDNA用SOD引物PCR凝膠電泳條帶,M為Trans 2KMarker)

    由圖4可見,經(jīng)過(guò)凍脅迫后,各處理葉片內(nèi)sod轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量幾乎沒有多大的變化。弱春性、半冬性和冬性中各小麥品種之間相比,小麥植株葉片內(nèi)sod基因在凍脅迫期間表達(dá)量基本一致,然而本實(shí)驗(yàn)中的春性小麥揚(yáng)麥15的對(duì)照組比實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量低。

    圖4 SOD引物半定量PCR凝膠電泳圖

    3 討論

    在本實(shí)驗(yàn)的8個(gè)小麥中,揚(yáng)麥15春性強(qiáng),煙農(nóng)19為冬性小麥,而鄭麥9023、淮麥30和中國(guó)春皆為弱春性小麥,濟(jì)麥22、煤生P2-1和皖農(nóng)墾2號(hào)都是半冬性小麥。在凍害處理之后,揚(yáng)麥15的凍死率最高,與其抗凍類型表現(xiàn)一致。而其他小麥品種沒有明顯差異,因此,可以初步得出推論:凍害脅迫后,春性小麥的sod基因轉(zhuǎn)錄水平會(huì)明顯升高。

    春性小麥、弱春性小麥和半冬性小麥在凍害處理后期,小麥植株的抗凍性顯著下降,因而植株凍害比較嚴(yán)重甚至凍死。而冬性小麥煙農(nóng)19在凍害處理后期抗凍性下降速率較為遲緩,所以植株未受凍害,僅一部分葉片枯死。在此次凍害處理中,春性小麥揚(yáng)麥15凍死率最高,抗凍性下降速率最快,而凍害處理后的揚(yáng)麥15的sod基因表達(dá)量明顯下降。這與預(yù)期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。

    植物的抗凍性是由很多個(gè)基因調(diào)控的數(shù)量性狀,已有研究表明sod基因的表達(dá)與植物的抗凍性密切相關(guān)。但是這些物質(zhì)在不同的植物中就會(huì)表現(xiàn)出不同的抗凍效果。Gabriela等[19]的研究表明sod參與了玉米的抗凍過(guò)程,而張燕等[6]認(rèn)為sod可能沒有參與Ca2+誘導(dǎo)的煙草的抗凍過(guò)程。

    本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,未經(jīng)低溫誘導(dǎo),春性小麥植株葉片內(nèi)sod基因的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量明顯比其他春化類型的小麥植株要低,而經(jīng)過(guò)低溫誘導(dǎo)后,春性小麥植株葉片內(nèi)的sod基因的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量顯著升高,這與植株間的抗凍基因的性質(zhì)基本一致,而酶的活性也顯示的相似的結(jié)果[5,20]。因此,可以推測(cè)sod參與了小麥植株的抗凍過(guò)程,可以作為小麥植株抗凍性的鑒定指標(biāo)。本文還發(fā)現(xiàn)弱春性、半冬性和冬性小麥不管是否進(jìn)行低溫誘導(dǎo),這些類型的小麥葉片中的sod基因的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量都無(wú)明顯的變化,進(jìn)而可以推測(cè)sod基因雖然參與了小麥植株的抗凍過(guò)程,但是可能不是小麥抗凍性的唯一的鑒定指標(biāo)。

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