紅花注射液在大鼠腦缺血/再灌注損傷中抗氧化作用的研究

廖梓亙 陳慧

紅花注射液在大鼠腦缺血/再灌注損傷中抗氧化作用的研究

廖梓亙 陳慧

目的 探討紅花注射液（SI)在大鼠腦缺血/再灌注損傷中超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的影響。方法 將40只健康SPrague-Dawley大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血/再灌注模型組、小劑量紅花組和大劑量紅花組，每組10只，分別在再灌注24h測(cè)定超氧化物歧化醉(SOD)活性和丙二醛（MDA）的含量，再灌注24h后取梗死灶腦組織行HE染色。結(jié)果 小劑量紅花組和大劑量紅花組SOD活性較缺血/再灌注模型組及假手術(shù)組有顯著增強(qiáng)（P＜0.05），并且大劑量紅花組較小劑量紅花組的SOD活性增強(qiáng)更明顯（t=79.871,P=0.000）；小劑量紅花組與大劑量紅花組MDA含量較缺血/再灌注模型組及假手術(shù)組有顯著減少（P＜0.05），并且大劑量紅花組較小劑量紅花組的MDA含量減少更明顯（t=-1.314,P=0.000）。結(jié)論 紅花注射液在大鼠腦缺血/再灌注損傷中通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體SOD活性,降低MDA含量，達(dá)到其保護(hù)作用。

大腦中動(dòng)脈閉塞；紅花注射液；超氧化物歧化酶；丙二醛

急性腦缺血損傷是目前發(fā)病率高、病死率高、致殘率高，嚴(yán)重威脅著人類健康的疾病，尋求保護(hù)方面的研究是主要目標(biāo)之一。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血/再灌注損傷后產(chǎn)生大量氧自由基等炎性因子，從而說(shuō)明氧化應(yīng)激機(jī)制是腦缺血/再灌注損傷的主要機(jī)制之一。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是體內(nèi)的主要氧自由基清除劑之一，丙二醛(malondialdehyde，MDA)是脂質(zhì)過(guò)氧化物產(chǎn)物之一，因此，通過(guò)具有清除氧自由基的藥物對(duì)缺血/再灌注損傷有神經(jīng)保護(hù)作用。

紅花為菊科植物,具有活血通經(jīng)、祛瘀止痛的功效,是傳統(tǒng)的活血化瘀類中藥,主要成分有紅花苷、紅花素、黃花素和總黃酮等，具有明顯降低腦缺血大鼠腦線粒體MDA含量、升高SOD活性、抑制Ca2+過(guò)多攝入[1]，本研究通過(guò)觀察不同劑量的紅花對(duì)大鼠腦缺血/再灌注損傷后細(xì)胞形態(tài)學(xué)及SOD活性及MDA含量的影響，探討紅花對(duì)腦保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 一般材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 40只清潔級(jí)健康雄性SD大鼠，雌雄不限，體質(zhì)量200～250g,由南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SYYK-025。本實(shí)驗(yàn)研究嚴(yán)格參照中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》[2]。40只大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、缺血/再灌注模型組、小劑量紅花組和大劑量紅花組，每組10只。

1.2 方法 造模成功后2h小劑量紅花組及大劑量紅花組分別腹腔注射紅花注射液1mL/kg和3mL/kg(山西華衛(wèi)有限公司)；假手術(shù)組,缺血/再灌注模型組分別腹腔注射等量的生理鹽水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的制備及評(píng)分參照Koizumi[3]方法制成大鼠大腦中動(dòng)脈缺血/再灌注模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO）造模術(shù)后2h觀察大鼠的癥狀和體征,采用Longa[4]評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。0分：正常（無(wú)神經(jīng)功能障礙）；1分：上肢不能完全伸展；2分：爬行時(shí)向左側(cè)劃圈；3分：爬行時(shí)向左側(cè)傾倒；4分：無(wú)自發(fā)性活動(dòng)伴意識(shí)障礙。剔除0分與4分；符合評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，但有蛛網(wǎng)膜下腔出血、術(shù)后死亡者，亦予以剔除，并隨機(jī)補(bǔ)充。

1.3 腦缺血再灌注后體積的測(cè)量 各組SD大鼠腦缺血模型分別在缺血2h后再灌注24h后，再次評(píng)分后，深度麻醉后并斷頭取腦，以視交叉和其后4mm處兩點(diǎn)冠狀切片，逐層切成2mm厚的腦片，置于2%的3，5-三苯基氯化四氮唑TTC溶液中孵育，然后固定、染色后，觀察腦組織：正常腦組織呈紅色，腦缺血組織呈白色。

1.4 HE染色觀察 所有大鼠缺血/再灌注24h后，再次評(píng)分，斷頭取腦后，取得的所有腦組織均用10%中性甲醛固定，石蠟包埋,組織連續(xù)冠狀切片，HE染色。

1.5 SOD活性測(cè)定 將各組大鼠經(jīng)心臟取血4mL，4000r/min離心15min，取上清液30μL，采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD含量，按試劑盒說(shuō)明操作。

1.6 MDA含量測(cè)定 用硫代巴比妥酸（TBA）比色法測(cè)定。將經(jīng)心臟取血4mL，離心半徑為4cm,離心速度為4000r/ min離心15min，取上清100μL，采用TBA比色法測(cè)定MDA含量，按試劑盒說(shuō)明操作。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用“x±s”表示，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紅花注射液對(duì)腦缺血/再灌注損傷后的大鼠神經(jīng)功能評(píng)分及腦梗死體積的影響 根據(jù)Longa評(píng)分，假手術(shù)組評(píng)分最低，無(wú)神經(jīng)功能障礙；缺血/再灌注模型組評(píng)分最高，神經(jīng)功能受損最嚴(yán)重。小劑量紅花組及大劑量紅花組神經(jīng)功能評(píng)分與缺血/再灌注模型組比較有顯著改善（P＜0.05）；大劑量紅花組較小劑量紅花組神經(jīng)功能評(píng)分改善更顯著（t=0.869,P=0.000）。小劑量紅花組及大劑量紅花組腦梗死體積與缺血/再灌注模型組比較，也有顯著改善（P＜0.05）；大劑量紅花組較小劑量紅花組腦梗死體積改善也更顯著（t=18.276,P=0.000）。見(jiàn)表1。

表1 紅花注射液對(duì)腦缺血/再灌注損傷后的大鼠神經(jīng)功能評(píng)分及腦梗死體積的影響(x±s，n=10)

2.2 HE染色 顯微鏡下可見(jiàn)：假手術(shù)組：神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)深染，核仁形態(tài)正常、飽滿；缺血再灌注模型組：神經(jīng)細(xì)胞大量變性壞死，細(xì)胞間間隙明顯增寬，細(xì)胞間質(zhì)空泡改變，細(xì)胞稀少，細(xì)胞水腫明顯，胞體縮小；小劑量紅花組：神經(jīng)細(xì)胞部分變性壞死，存活的神經(jīng)細(xì)胞較多，凋亡細(xì)胞相對(duì)減少，細(xì)胞水腫明顯，部分細(xì)胞形態(tài)相對(duì)正常；大劑量紅花組：神經(jīng)細(xì)胞少部分變性壞死，存活的神經(jīng)細(xì)胞增多，凋亡細(xì)胞減少，多數(shù)細(xì)胞形態(tài)正常。見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠腦缺血/再灌注損傷24小時(shí)腦組織病理組織變化（HE染色×400）

2.3 紅花注射液對(duì)腦缺血/再灌注損傷后大鼠腦組織中SOD活性和MDA含量的影響 小劑量紅花組、大劑量紅花組SOD活性和缺血/再灌注模型組與假手術(shù)組相比較有顯著增高（均P＜0.05）；其中大劑量紅花組較小劑量紅花組SOD活性增高更顯著（t=79.871,P=0.000）。小劑量紅花組、大劑量紅花組MDA含量和缺血/再灌注模型組與假手術(shù)組相比較有顯著減少（P＜0.05）；其中大劑量紅花組較小劑量紅花組MDA含量減少更顯著（t=-1.314,P=0.000）。見(jiàn)表2。

表2 紅花注射液對(duì)腦缺血/再灌注損傷后的超氧化物歧化酶和丙二醛的影響(x±s，n=10)

3 討論

既往研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激是腦缺血/再灌注損傷的機(jī)制之一，腦缺血/再灌注損傷后激活大量的酶性物質(zhì)引發(fā)一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng),產(chǎn)生大量氧自由基，導(dǎo)致一系列病理生理改變?？寡趸镔|(zhì)不斷清除體內(nèi)過(guò)多的氧自由基,以保持體內(nèi)內(nèi)環(huán)境自由基的動(dòng)態(tài)平衡，不發(fā)生自由基連鎖反應(yīng)和組織損傷[5]。腦缺血后，啟動(dòng)氧化應(yīng)激機(jī)制，使得體內(nèi)SOD消耗過(guò)多，MDA生成增加，動(dòng)態(tài)平衡打破，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞變性壞死進(jìn)一步加重。氧化應(yīng)激機(jī)制可能通過(guò)以下途徑：（1）氧自由基激活炎性因子：如腫瘤壞死因子（TNF）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）等大量釋放，致使小膠質(zhì)細(xì)胞被激活產(chǎn)生大量的炎癥反應(yīng)；（2）進(jìn)一步損害細(xì)胞蛋白質(zhì)、糖和脂肪酸等導(dǎo)致細(xì)胞變性壞死；（3）氧自由基還可損傷腦細(xì)胞的DNA,進(jìn)而和其他機(jī)制共同作用最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；（4）加速體內(nèi)三羧酸循環(huán)代謝，更進(jìn)一步增加了氧自由基的產(chǎn)生，造成細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+增加,鈣離子超載的作用進(jìn)一步增加,致上述惡性循環(huán)反復(fù)進(jìn)行而加重腦損傷。

近年來(lái)的研究表明，紅花注射液目前被人們所廣泛認(rèn)可并主要用于治療冠心病、心絞痛、脈管炎等多種血液循環(huán)障礙疾病的治療[6]。紅花注射液具有鎮(zhèn)痛、抗氧化、降脂、抗炎等作用，對(duì)血栓形成有一定抑制作用[7]，還可以能明顯減輕由腦卒中引起的腦水腫[8]，改善血管阻力、擴(kuò)張血管、增加腦部血流量、改善及增加纖維蛋白溶酶的活性、加強(qiáng)血栓溶解等，對(duì)血小板凝集有抑制作用，對(duì)缺氧缺血組織具有保護(hù)作用，紅花注射液具有減輕腦梗死患者的神經(jīng)損傷[9-10]及改善血液動(dòng)力學(xué)的作用[11]。本研究結(jié)果顯示，Longa評(píng)分越高，神經(jīng)功能損害越嚴(yán)重，所以缺血/再灌注模型組評(píng)分最高，神經(jīng)功能受損最嚴(yán)重；予以紅花注射液后，評(píng)分下降明顯，神經(jīng)功能損害顯著改善，尤其以大劑量紅花組更為明顯。紅花注射液組腦梗死體積較缺血/再灌注模型組明顯縮小，而紅花注射液中以大劑量組梗死體積縮小更明顯，提示紅花注射液在一定劑量的范圍內(nèi)，劑量越大，神經(jīng)功能損害及梗死體積縮小越明顯。

HE染色顯示，缺血/再灌注模型組的神經(jīng)細(xì)胞損害最嚴(yán)重，細(xì)胞凋亡最明顯，細(xì)胞核變性壞死最嚴(yán)重，相比予以紅花注射液腹腔注射后，神經(jīng)細(xì)胞得到一定程度的改善，細(xì)胞凋亡減少，細(xì)胞形態(tài)部分正常；而大劑量紅花注射液組提示細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞數(shù)及核仁明顯改善。結(jié)果表明，紅花注射液具有保護(hù)作用，與以往結(jié)果相一致[12]。

本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，缺血/再灌注模型組的SOD活性顯著降低，MDA含量顯著增高，提示氧化應(yīng)激參與了腦缺血/再灌注損傷的病理生理過(guò)程，2h再灌注后24h后取血再檢查，小劑量紅花組及大劑量紅花組SOD活性與缺血再灌注模型組和假手術(shù)組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中大劑量紅花組比小劑量紅花組SOD活性增高值高，提示紅花注射液能提高大鼠腦缺血血液中SOD活性。

綜上所述，紅花注射液對(duì)大鼠腦缺血/再灌注后，可以改善神經(jīng)功能評(píng)分,改善缺血區(qū)域的供血，減少腦梗死體積方面差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,使得缺血/再灌注后細(xì)胞學(xué)形態(tài)得到明顯改善，神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量明顯增加，提高缺血區(qū)SOD活性和減少M(fèi)DA含量，尤以提高SOD的含量顯著,表明紅花注射液具有較強(qiáng)的抗自由基作用，從而對(duì)缺血/再灌注起到保護(hù)作用。

[1] 田京偉，傅風(fēng)華，蔣王林，等.羥基紅花黃色素A對(duì)腦缺血所致大鼠腦線粒體損傷的保護(hù)作用[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2004，39(10)：774.

［2］ 中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部.關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)[S]. 2006-09-30.

[3] Koizumi J，Yoshida Y，Nakazawa T，et al．Experimental studies of ischemicbrain edema：A new experiment model of cerebralem bolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area[J]．Stroke，1986，8（1）：1-8.

[4] Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without Craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20（1）：84-91．

[5] Suzuki J．Chemiluminescence in hypoxic brain[J]．Stroke，1988，19：65.

[6] 林濤．紅花注射液對(duì)冠心病患者冠脈血流、抗氧化能力及脂質(zhì)代謝的影響[J].重慶醫(yī)學(xué)，2012，41（31）：3267-3269.

[7] 王來(lái)銀.紅花注射液的臨床應(yīng)用概況[J].中國(guó)藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)，2013，10(11)：66-67.

[8] 懂澤宏，佘靖.中藥現(xiàn)代研究與應(yīng)用(第三卷)[M].北京：學(xué)院出版社，1998：2057.

[9] 徐開(kāi)蕾，范華昌，劉龍民，等.紅花注射液頸動(dòng)脈灌注治療腦梗死的療效及對(duì)大鼠腦線粒體影響的研究[J].中成藥，2010，32（9）：1472-1476.

[10] 秦松苗.紅花注射液治療急性腦梗死療效觀察[J].中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾病雜志，2011，14（12）：86-87.

[11] 趙欣欣，黃蘭，唐發(fā)寶.紅花注射液對(duì)腦梗死血液流變學(xué)影響的Meta分析[J].中國(guó)藥房，2011，22（15）：1413-1415.

[12] 歐芹，魏曉東，孫鵬，等.紅花黃色素對(duì)衰老模型小鼠腦細(xì)胞凋亡的影響[J].中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2006，21（6）：504.

Objective To investigate the effect of safflor injection on superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) in rats with cerebral ischemia and reperfusion injury. Methods 40 healthy Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham operation group, ischemia reperfusion model group, low dose group, large dose of safflor group, 10 rats in each group. The contents of SOD activity and MDA were measured by 24h assay, and the HE staining was performed after reperfusion 24h. Results The activity of SOD was significantly enhanced in the small dose group and large dose group (P＜0.05), and the SOD activity was significantly higher in the large dose group (t=79.871，P=0.000 ), and the MDA in the low dose group and the sham operation group (t=-1.314，P=0.000). Conclusion The effect of safflor injection on the SOD activity and the protective effect of MDA in rats with cerebral ischemia and reperfusion injury was reduced.

Middle cerebral artery occlusion；Safflor injection;Superoxide dismutase；Malondialdehyde

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.35.003

湖南 421001 南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（ 廖梓亙） 廣東510288 廣州市中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院南院急診科（ 陳慧）