天山雪蓮藥材與雪蓮注射液指紋圖譜相關(guān)性研究

劉 婧，許麗佳，何正有，李 維，鄒 昆，姚 潔

(1.成都大學(xué) 四川抗菌素工業(yè)研究所，四川 成都 610052;2.成都大學(xué) 外國(guó)語學(xué)院，四川 成都 610106)

0 引 言

天山雪蓮是菊科植物天山雪蓮的干燥地上部分，具有補(bǔ)腎活血、強(qiáng)筋骨等功效［1］.雪蓮注射液是由天山雪蓮經(jīng)提取、精制而成的注射液，具有消炎鎮(zhèn)痛、消腫、活血化瘀等功效，臨床上用于治療急、慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及骨關(guān)節(jié)炎引起的關(guān)節(jié)疼痛等癥［2］.相關(guān)研究表明，中藥指紋圖譜能整體、特征與穩(wěn)定地控制中藥及其制劑質(zhì)量［3－5］.本研究根據(jù)《中藥注射劑指紋圖譜的技術(shù)要求(暫行)》，對(duì)天山雪蓮及雪蓮注射液的指紋圖譜進(jìn)行研究，并通過指紋圖譜各共有峰對(duì)兩者的相關(guān)性進(jìn)行研究，擬為提高雪蓮注射液的工藝與質(zhì)量控制水平提供參考.

1 儀器與材料

1.1 儀 器

實(shí)驗(yàn)所用儀器包括:Agilent 1200 型高效液相色譜儀(配有紫外檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、四元梯度泵、在線脫氣裝置、Agilent Chem Station 色譜工作站，美國(guó)Agilent 公司);Ultimate XB-C18色譜柱(250 ×4.6 mm，5 μm，美國(guó)Welch 公司);AE240 型分析天平(瑞士METTLER 公司).

1.2 試 藥

實(shí)驗(yàn)所用試藥包括:甲醇，色譜純，由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn);水為超純水，其他試劑均為分析純;紫丁香苷(批號(hào)，111574－200603)、綠原酸(批號(hào)，110753－ 200413)、蘆丁(批號(hào)，100080－200707)對(duì)照品，均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所.

1.3 樣 品

實(shí)驗(yàn)所用樣品包括:天山雪蓮(新疆和靜)，由國(guó)藥集團(tuán)新疆制藥有限公司提供，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)胡慧玲老師鑒定為菊科植物天山雪蓮的干燥地上部分，符合《中國(guó)藥典》2010年版一部有關(guān)各項(xiàng)的規(guī)定，共10 批.雪蓮注射液共11 批，由國(guó)藥集團(tuán)新疆制藥有限公司提供.

2 方法與結(jié)果

2.1 指紋圖譜色譜條件

實(shí)驗(yàn)的色譜條件為:色譜柱為Ultimate XB-C18(4.6 ×250 mm，5 μm).以0.06%醋酸水為流動(dòng)相A，以0.14%醋酸甲醇為流動(dòng)相B.梯度洗脫，0 ～18 min，B(5%)，流速(0.5 mL·min－1);18 ～45 min，B(5% ～22%)，流速(0.5mL·min－1);45 ～55 min，B(22%)，流速(1.0 mL·min－1);55 ～95 min，B(22% ～60%)，流速(1.0mL·min－1);95 ～100 min，B(60%)，流速(1.0 mL·min－1);柱溫為25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm，進(jìn)樣量為5 μL;理論板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算應(yīng)不低于8 000.

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備.

精密稱取紫丁香苷、綠原酸、蘆丁對(duì)照品適量，120 ℃干燥至恒重，加甲醇制成每1 mL 中分別含紫丁香苷、綠原酸、蘆丁0.118、0.108、0.2092 mg 的對(duì)照品溶液.

2.2.2 天山雪蓮供試品的制備.

取雪蓮粉末4 g，過三號(hào)篩，加100 mL 水，稱重，超聲提取30 min，室溫放置，用水補(bǔ)重，用0.45 μm微孔濾膜過濾，制得供試品溶液.

2.2.3 雪蓮注射液供試品的制備.

取本品用0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，制得注射液供試品溶液.

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn).

取天山雪蓮供試品溶液和雪蓮注射液供試品溶液各1 份，連續(xù)進(jìn)樣6 次，檢測(cè)其指紋圖譜，以紫丁香苷峰為參照峰，計(jì)算主要共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積.結(jié)果顯示，其相對(duì)保留時(shí)間的RSD均＜0.571%，相對(duì)峰面積的RSD 均＜1.644%，表明本方法精密度良好.

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn).

取天山雪蓮供試品溶液和雪蓮注射液供試品溶液各1 份，分別于0、4、8、12、24、36 h 檢測(cè)指紋圖譜，以紫丁香苷峰為參照峰，計(jì)算主要共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積.結(jié)果顯示，其相對(duì)保留時(shí)間的RSD 均小于1.493%，相對(duì)峰面積的RSD 均小于2.437%，表明本方法穩(wěn)定性良好.

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn).

取天山雪蓮供試品溶液和雪蓮注射液供試品溶液各6 份，分別檢測(cè)其指紋圖譜，以紫丁香苷峰為參照峰，計(jì)算主要共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積.結(jié)果顯示，其相對(duì)保留時(shí)間的RSD 均小于1.547%，相對(duì)峰面積的RSD 均小于2.669%，表明本方法重復(fù)性良好.

2.4 樣品測(cè)定

按照高效液相色譜法［1］分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、天山雪蓮供試品溶液和雪蓮注射液供試品溶液5 μL，注入液相色譜儀，記錄100 min 色譜圖.

2.5 指紋圖譜共有模式的建立

分別將10 批天山雪蓮和11 批雪蓮注射液的指紋圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”軟件，采用中位數(shù)法生成天山雪蓮和雪蓮注射液的對(duì)照?qǐng)D譜.指紋圖譜如圖1、2 所示，對(duì)照?qǐng)D譜如圖3、4 所示.

圖1 天山雪蓮指紋圖譜

圖2 雪蓮注射液指紋圖譜

圖3 天山雪蓮對(duì)照?qǐng)D譜

圖4 雪蓮注射液對(duì)照?qǐng)D譜

2.6 相似度分析

分別將10 批天山雪蓮和11 批雪蓮注射液的指紋圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”軟件，對(duì)各樣品與其對(duì)照?qǐng)D譜進(jìn)行比較，其相似度結(jié)果見表1.

表1 天山雪蓮和雪蓮注射液各批樣品的相似度分析結(jié)果

2.7 天山雪蓮與雪蓮注射液相關(guān)性分析

在天山雪蓮對(duì)照?qǐng)D譜中，第9 號(hào)峰為紫丁香苷峰，在雪蓮注射液對(duì)照?qǐng)D譜中，第14 號(hào)峰紫丁香苷峰.因?yàn)樽隙∠丬赵谔焐窖┥徍脱┥徸⑸湟褐谐龇鍟r(shí)間及峰面積較穩(wěn)定，所以選擇紫丁香苷為參比峰.以紫丁香苷的出峰時(shí)間為1，分別計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果見表2.

表2 天山雪蓮和雪蓮注射液各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

對(duì)天山雪蓮與雪蓮注射液各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間對(duì)比分析可見，雪蓮注射液中的峰1、5、6、7、9、11、14、15、17 均來自天山雪蓮藥材.作為天山雪蓮含量測(cè)定成分的紫丁香苷、綠原酸和蘆丁分別是天山雪蓮對(duì)照?qǐng)D譜中共有峰的第9、10 和12 號(hào)峰，雪蓮注射液對(duì)照?qǐng)D譜中第14、15 和17 號(hào)峰，其中綠原酸和蘆丁的相對(duì)峰面積分別在天山雪蓮中的1.12和3.36，雪蓮注射液中的0.58 和0.67.

3 討 論

1)本研究色譜條件分別考察了色譜柱、流動(dòng)相、柱溫和檢測(cè)波長(zhǎng)，選擇圖譜基線較平穩(wěn)、色譜峰數(shù)目較多且分離度較好的色譜條件:Ultimate XBC18(4.6 ×250 mm，5 μm)色譜柱，0.06%醋酸水—0.14%醋酸甲醇，梯度洗脫，柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm.

2)對(duì)10 批天山雪蓮樣品進(jìn)行分析，其相似度在0.866 ～0.926 范圍，有兩批樣品(S1，S10)相似度小于0.90.由于天山雪蓮生長(zhǎng)在海拔3 500 m 以上，生長(zhǎng)環(huán)境極為復(fù)雜，自然生長(zhǎng)周期達(dá)5 ～8年，并且人工栽培困難，所以天山雪蓮的化學(xué)成分有一定的差異［6－7］.

3)對(duì)11 批雪蓮注射液進(jìn)行分析，指紋圖譜整體相似，各批次的色譜峰數(shù)和峰面積差異較小，其相似度大于0.90，可認(rèn)為其相似度良好.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雪蓮注射液制備工藝的穩(wěn)定性良好，各批次樣品差異較小.

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典［M］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

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