亞麻油渣提取物制備工藝研究

徐玉玲，譚 平，羅小偉，潘迎志，吳南軒，梁 悅，劉 濤

(1.成都大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 成都 610106;2.湖北省 秭歸縣人民醫(yī)院，湖北 秭歸 443600)

0 引 言

亞麻油渣為胡麻油籽經(jīng)過(guò)壓榨或提取其所含植物油后所得的油渣.研究發(fā)現(xiàn)，亞麻油渣中含有以亞麻木酚素為代表的具有生理活性的物質(zhì)，它對(duì)雌激素依賴性疾病與骨質(zhì)疏松等癥有預(yù)防作用，目前，亞麻木酚素已被開(kāi)發(fā)制成藥品和保健品，同時(shí)也作為食品的添加劑［1－3］.亞麻木酚素為無(wú)色晶形，可溶于水、甲醇、含水乙醇和丙醇，易被酶水解，其提取方法有溶劑浸提法、回流提取法、微生物發(fā)酵法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法等［4－5］.本研究主要對(duì)亞麻油渣的處理方式、亞麻木酚素的提取工藝及其分離純化方法進(jìn)行了研究.

1 材料與儀器

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)所用材料包括:亞麻油渣(批號(hào)，20130617)，購(gòu)于山西神池縣福淵土特產(chǎn)品開(kāi)發(fā)有限公司;亞麻木酚素對(duì)照品(批號(hào)，20130617)，由中國(guó)食品藥品檢定研究所提供;AB-8 型大孔吸附樹(shù)脂，購(gòu)于天津波鴻樹(shù)脂科技有限公司;乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑為分析純.

1.2 儀 器

實(shí)驗(yàn)所用儀器包括:KQ-100 型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)，RE-5205B 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海榮生儀器廠)，P2302II 型高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司生產(chǎn)).

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

實(shí)驗(yàn)的色譜條件為:色譜柱，GS-120-5-C18-AP(4.6 nmID ×250 mm，5 mL);流動(dòng)相為，乙腈和水(70∶ 30)，流速，1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)，280 nm，進(jìn)樣量10 μL，柱溫25 ℃.

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取亞麻木酚素標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg，精密稱定，置于10 mL 容量瓶中，加入甲醇至刻度，搖勻，制得對(duì)照品溶液，其HPLC 圖譜見(jiàn)圖1.

2.3 供試品溶液的制備

取亞麻油渣顆粒400 g，放于5 000 mL 蒸餾燒瓶中，加3 200 mL 濃度為70%的乙醇溶液，加熱回流提取2 h.濃縮提取液至適量，向濃縮液中加入2 mol/L的NaOH 溶液至pH 值為8，一段時(shí)間后，加入2 mol/L 硫酸溶液至pH 值為4，離心除沉淀，加入蒸餾水定容至800 mL，制得供試品溶液，其HPLC 圖譜見(jiàn)圖2.

2.4 線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液，2、4、6、8、10、12、14 μL分別進(jìn)樣，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，測(cè)定峰面積，以峰面積Y 對(duì)進(jìn)樣量X 進(jìn)行線性回歸得亞麻木酚素線性回歸方程，y =368.53X－50.752，r =0.9997.結(jié)果表明，亞麻木酚素在1.86 ～13.02 μg 范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好線性關(guān)系.

2.5 測(cè)定法

精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算.

圖1 亞麻木酚素對(duì)照品HPLC 圖譜

圖2 亞麻油渣樣品HPLC 圖譜

2.6 提取工藝研究

研究發(fā)現(xiàn)，亞麻油渣提取過(guò)程中的影響因素主要為乙醇濃度、加醇量、提取時(shí)間及提取次數(shù)4 個(gè)因素［6－8］，本實(shí)驗(yàn)對(duì)此進(jìn)行了研究.

2.6.1 單因素實(shí)驗(yàn)的考察.

相關(guān)文獻(xiàn)中，選擇70%的乙醇溶液作為提取溶媒較多［6－8］，所以本實(shí)驗(yàn)選擇乙醇濃度為60%、70%、80%，并在這3 個(gè)水平進(jìn)行考察.實(shí)驗(yàn)最終確定乙醇濃度為70%.

2.6.2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平確定.

以乙醇為提取溶媒，選取提取時(shí)間(A)、提取次數(shù)(B)、加醇倍數(shù)(C))為考察因素，以提取液中亞麻木酚素及固含物的量為考察指標(biāo)，綜合加權(quán)評(píng)分，采用L9(34)正交表安排實(shí)驗(yàn)，因素水平表見(jiàn)表1.

表1 提取工藝因素水平表

2.6.3 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果.

分別取9 組亞麻油渣藥材(每組100 g)，按照正交實(shí)驗(yàn)安排表(表2)進(jìn)行回流提取正交實(shí)驗(yàn)，提取液含量測(cè)定方法按“2.5”項(xiàng)方法進(jìn)行.結(jié)果如表2所示，方差分析如表3 所示.

表2 正交實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)方差分析表

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3 個(gè)因素對(duì)從亞麻油渣中木酚素提取效果影響順序從大到小分別為，提取次數(shù)＞加醇倍數(shù)＞提取時(shí)間.方差分析表顯示，提取次數(shù)和加醇倍數(shù)對(duì)提取效果影響均顯著.綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取A1B3C3作為本提取工藝的最佳參數(shù)，即:藥材中加入16 倍量70%乙醇，提取3 次，每次1 h.

2.6.4 提取工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn).

取3 組亞麻油渣顆粒物，1、2 組100 g，3 組200 g，1、2 組加入1 600 mL 70%的乙醇，3 組入3 200 mL 70%的乙醇分別提取3 次，每次1 h，合并提取液，測(cè)定提取液中木酚素的含量，結(jié)果如表4 所示.

表4 提取工藝驗(yàn)證結(jié)果表

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本提取工藝穩(wěn)定、可行.

3 亞麻木酚素的分離純化研究

3.1 樹(shù)脂優(yōu)選實(shí)驗(yàn)

為對(duì)樹(shù)脂進(jìn)行優(yōu)選，本實(shí)驗(yàn)取處理好的HPD100、D101、AB-8、HPD300、HPD600 型大孔樹(shù)脂各7 g 于100 mL 燒杯中，用移液管移取經(jīng)離心處理的樣品液各50 mL 于各型號(hào)大孔樹(shù)脂中進(jìn)行吸附，隔10 min、30 min、1 h、2 h 各震蕩一次，靜置24 h.取適量上清液，測(cè)定各樹(shù)脂吸附亞麻木酚素的含量，測(cè)定結(jié)果如表5 所示，計(jì)算公式為，

表5 不同類型樹(shù)脂對(duì)亞麻木酚素的吸附率

表5 結(jié)果表明，AB-8 型大孔樹(shù)脂對(duì)亞麻木酚素的吸附能力最好.

3.2 上樣量

取預(yù)處理好的20 g AB-8 型大孔樹(shù)脂裝入內(nèi)徑1.6 cm，長(zhǎng)30 cm 的玻璃層析柱中，用純凈水洗至無(wú)醇味.加入離心處理的樣品溶液80 mL 以2 BV/h 流速上樣，控制流出液流速3 BV/h ，每5 mL 收集一次流出液，總共收集10 份，結(jié)果如圖3 所示.

圖3 AB-8 型樹(shù)脂吸附亞麻木酚素的保留率

從圖3 可看出，當(dāng)亞麻木酚素提取液的上樣體積加至45 mL 時(shí)(9 份)，AB-8 型大孔樹(shù)脂吸附亞麻木酚素的保留率開(kāi)始低于95%，可認(rèn)為AB-8 型大孔樹(shù)脂柱開(kāi)始出現(xiàn)泄漏，故初步確定樹(shù)脂的上樣量為45 mL.計(jì)算出單位AB-8 型大孔樹(shù)脂吸附量為3.40 mg/g.

3.3 洗脫溶劑選擇

稱取5 組預(yù)處理好的20 g AB-8 型大孔樹(shù)脂，分別裝入內(nèi)徑2.8 cm，長(zhǎng)30 cm 的5 支同規(guī)格的玻璃層析柱中，用純凈水洗至無(wú)醇味，加入離心處理的樣品液45 mL 上樣吸附.充分吸附后，用純凈水洗至流出液無(wú)色，再分別用10%、20%、30%、40%、50%、的乙醇溶液100 mL 洗脫，并收集各流出液，解吸率結(jié)果如表6 所示，其計(jì)算公式為，

表6 不同濃度溶劑洗脫下AB-8 型樹(shù)脂對(duì)亞麻木酚素的解吸率

表6 結(jié)果表明，30%的乙醇溶液洗脫能力最強(qiáng).

3.4 洗脫溶劑用量

稱取預(yù)處理好的20 g AB-8 型大孔樹(shù)脂，裝入內(nèi)徑1.6 cm，長(zhǎng)30 cm 的玻璃層析柱中，用純凈水洗至無(wú)醇味，加入離心處理的樣品液45 mL 上樣吸附.充分吸附后，用純凈水洗至流出液無(wú)色，再用體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液洗脫，每45 mL 收集一次洗脫液，收集7 次，結(jié)果如圖4 所示.

圖4 不同倍數(shù)乙醇對(duì)吸附在AB-8 型樹(shù)脂上亞麻木酚素的解吸率

圖4 結(jié)果表明，6 BV 的乙醇溶液能對(duì)AB-8 型大孔樹(shù)脂吸附的亞麻木酚素能完全洗脫，其單位AB-8 型大孔樹(shù)脂吸附量為3.44 mg/g.

3.5 純化工藝驗(yàn)證

取3 組處理好的AB-8 型大孔樹(shù)脂，1、2 組20 g，分別裝入內(nèi)徑1.6 cm，長(zhǎng)30 cm 的2 支同規(guī)格玻璃層析柱中(徑高比1.6∶ 16)，3 組40 g，裝入內(nèi)徑2.6 cm，長(zhǎng)20 cm 的玻璃層析柱中(徑高比2.6∶ 20)，用純凈水洗至無(wú)醇味，1、2 組加入離心處理的樣品液45 mL，3 組加入離心處理的樣品液90 mL，采用2 BV/h 流速上樣，6 BV 的30%乙醇，3 BV/h 洗脫，收集各組洗脫液，測(cè)定洗脫液中木酚素的含量，結(jié)果如表7 所示.

表7 純化工藝驗(yàn)證結(jié)果表

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本純化工藝穩(wěn)定、可行.

4 結(jié)論與討論

1)通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)亞麻木酚素的提取工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到的最佳工藝為:用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇，料液比1∶ 16，提取3 次，每次1 h.樹(shù)脂優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:AB-8 型大孔樹(shù)脂最適合分離純化亞麻油渣提取物.對(duì)上樣量的研究、洗脫溶劑選擇研究、洗脫溶劑用量研究的優(yōu)化，得到的最佳純化工藝為:2 BV/h 流速上樣，6 BV 的30%乙醇，3 BV/h洗脫.

2)查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，大孔樹(shù)脂的洗脫流速在1 ～5 BV/h 之間變化，對(duì)樣品的洗脫影響不大［9－11］.考慮到工作效率，本實(shí)驗(yàn)選擇洗脫流速為3 BV/h 的AB-8 型大孔吸附樹(shù)脂對(duì)樣品分離純化后可重復(fù)使用，提高了工藝安全性和經(jīng)濟(jì)性.

3)目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道用亞麻油渣提取制備亞麻木酚素的工藝研究較少，實(shí)驗(yàn)所選原藥材經(jīng)過(guò)提取后的亞麻油渣仍可作家畜的飼料使用，大大地提高了亞麻油渣的綜合利用價(jià)值.本研究提取工藝簡(jiǎn)單，提取溶媒價(jià)廉，不采用有機(jī)溶媒萃取，不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，生產(chǎn)成本低，回收后的乙醇仍可以重復(fù)使用，極大地降低了生產(chǎn)成本.

4)本實(shí)驗(yàn)對(duì)溶劑浸提法、回流提取法進(jìn)行了研究.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，回流提取方法更佳，而且回流法提取工藝具有提取周期短，操作便捷，提取效率高，所用溶劑少等優(yōu)點(diǎn)，故本次實(shí)驗(yàn)選取回流法提取工藝.另外，由于亞麻油渣呈顆粒狀，研究表明，對(duì)其進(jìn)行粉碎對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定影響，但顆粒大小對(duì)提取效果影響不大.

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