煎煮法提取卷葉貝母組培物總生物堿研究

王躍華，徐恩琴，郭翠平，梅 英，劉 濤，王曉蓉

(1.成都大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 成都 610016;2.成都恩威集團(tuán)(投資)有限公司，四川 成都 610041)

0 引 言

我國(guó)已有悠久煎煮中草藥的歷史，湯藥制劑有利于人體對(duì)有效成分的吸收，其在臨床和制品開發(fā)上發(fā)揮著重要作用.目前，湯藥制劑的發(fā)展方向之一是以單味中藥干浸膏顆粒取代藥材飲片配方，而水煎煮法正是提取藥材浸膏和實(shí)現(xiàn)藥材浸膏工業(yè)化生產(chǎn)的主要方法.本研究的實(shí)驗(yàn)材料是利用生物技術(shù)快速生產(chǎn)的具有清熱潤(rùn)肺、化痰止咳和散結(jié)消癰功效的卷葉貝母組培物［1］.而在卷葉貝母組培物的提取過程中未見有用水煎煮法來提取其有效成分的的報(bào)道，對(duì)此，本實(shí)驗(yàn)考查了提取材料大小、浸泡時(shí)間和煎煮時(shí)間等因素對(duì)提取卷葉貝母組培物總生物堿含量的影響.

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣 品.

實(shí)驗(yàn)所用樣品包括:卷葉貝母組培物由成都大學(xué)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室利用組織培養(yǎng)技術(shù)快速生產(chǎn);貝母素乙購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所(批號(hào)，110751－200608).

1.1.2 藥品與試劑.

實(shí)驗(yàn)所用的三氯甲烷、鄰苯二甲酸氫甲、溴甲酚綠、氫氧化鈉和磷酸二氫鉀等藥品均為分析純，購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠.

1.1.3 儀 器.

實(shí)驗(yàn)所用儀器包括:UV-210A 型紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)，DHG-9141 型電熱恒溫干燥箱(上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司)，BS-6KH 型電子天平(上海友聲衡器有限公司)，電子萬用爐、粉碎機(jī)和藥典篩等.

1.2 方 法

1.2.1 提取實(shí)驗(yàn)方法.

將已干燥的卷葉貝母組培物粉碎成不同大小后，分別各稱取5 g 于燒杯中加水煎煮，開始用大火(武火)煎煮，沸騰后改用小火(文火)煎煮［2－3］.本實(shí)驗(yàn)煎煮次數(shù)由“頭煎”和“二煎”兩次組成，每次煎煮完畢都需趁熱分離出濾液，兩次濾液混合后獲得提取液;提取液經(jīng)萃取后采用紫外分光光度法測(cè)定其總生物堿含量.

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線確定.

精密稱取貝母素乙2.6 mg 于100 mL 容量瓶中，氯仿溶解并加至刻度，制得濃度為26 μg·mL－1的溶液.精密吸取該溶液1、2、4、6、8 mL，分別置于60 mL 分液漏斗中，加氯仿8 mL，pH 值為5 的緩沖溶液(0.2 mol·L－1鄰苯二甲酸氫甲溶液25 mL.0.2 mol·L－1氫氧化鈉溶液11.8 mL 混勻制得)5 mL.溴麝香草酚蘭溶液(溴麝香草酚蘭0.3 g 溶于1 mol·L－1NaOH 5 mL 中，加水稀釋至1 000 mL 制得)2 mL，劇烈振搖，靜置5 min;氯仿層經(jīng)干燥濾紙過濾，以氯仿為空白，在412 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，并以吸光度為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)線［4］，其方程為，A=0.0443C+0.0084，n=5，r=0.9994.

2 結(jié)果與討論

2.1 材料大小對(duì)總生物堿含量的影響

分別稱取粉碎為不同大小的卷葉貝母組培物A1、A2、A3、A4 和A5 各5 g 于燒杯中，“頭煎”加水300 mL 水浸泡50 min 后，放在電爐上先用武火煮沸3 min 后，再用文火慢熬40 min，煎煮完畢后，放置于轉(zhuǎn)速為8 000 r/min 的離心機(jī)中趁熱離心10 min，通過離心增加其有效成分的含量并分離出濾液［5］.“二煎”不經(jīng)浸泡，直接加水300 mL 進(jìn)行煎煮.將兩次煎煮濾液混合后獲得提取，然后將所得提取液濃縮為25 mL 后，用三氯甲烷萃取后再用紫外分光光度計(jì)在412 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，并計(jì)算出總生物堿含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果如表1 所示.

表1 煎煮材料大小對(duì)總生物堿含量的影響

由表1 可見，采用不同大小的卷葉貝母組培物材料進(jìn)行煎煮提取，最后測(cè)得的總生物堿含量都有所不同.選擇A3 即煎煮材料為245 μm 大小時(shí)提取的組培物中總生物堿含量為最高0.1433%，而以A5 即煎煮材料為833 μm 大小時(shí)提取的組培物中總生物堿含量為最低僅為0.1101%，這是由于提取材料的體積越大，其比表面積就越小，即與溶媒的接觸面積也就相對(duì)變小，從而使得細(xì)胞中的生物堿析出量也就減少.但是，提取材料也并非是的體積越小越好，如A1 即煎煮材料為165 μm 大小時(shí)提取的組培物材料中的總生物堿含量也較低為0.1267%，這主要是由于卷葉貝母組培物細(xì)胞中含有較多的淀粉粒，當(dāng)采用體積過小的組培材料進(jìn)行煎煮時(shí)，大量糊化的淀粉粒會(huì)嚴(yán)重影響到后續(xù)生物堿的分離純化［6］，最終導(dǎo)致提取的總生物堿含量下降.

2.2 浸泡時(shí)間對(duì)總生物堿含量的影響

中藥材通常都是經(jīng)過簡(jiǎn)單干燥加工的，多數(shù)藥材在使用時(shí)，若不事先采用水浸泡而直接采用高溫煎煮，常會(huì)造成藥材表面蛋白質(zhì)的固化和細(xì)胞中淀粉的糊化，從而阻塞藥材的毛細(xì)管孔隙，進(jìn)而影響藥物中有效成分的煎出［7］.本實(shí)驗(yàn)分別采取將卷葉貝母組培物的提取材料用水浸泡30、40、50、60 和70 min，其編號(hào)設(shè)定為B1、B2、B3、B4 和B5，結(jié)果如表2所示.

表2 浸泡時(shí)間對(duì)總生物堿含量的影響

由表2 可知，采用不同的浸泡時(shí)間，其最終測(cè)得的總生物堿含量也是不一樣的.實(shí)驗(yàn)中，浸泡了50 min 的B3 卷葉貝母組培物材料，其煎煮出的的總生物堿含量最高為0.1469%，而B1 和B2 分別為浸泡了30 min 和40 min，其煎煮出來的總生物堿都比B3低.這是由于采用較短時(shí)間浸泡的煎煮材料，因藥材細(xì)胞并未完全吸水膨脹，從而使得細(xì)胞中的有效成分不能充分溶解并滲出細(xì)胞外，結(jié)果煎煮后的得率及其有效成分提取量均較低［8］.但是，浸泡時(shí)間過久，會(huì)使得藥材細(xì)胞中大量的非提取成分也浸提出來，影響煎煮材料中生物堿分離純化，最終導(dǎo)致提取的總生物堿含量下降，例如B4、B5.

2.3 煎煮時(shí)間對(duì)總生物堿含量的影響

本實(shí)驗(yàn)用武火煮沸3 min 后，再分別采用文火煎煮20、30、40、50 和60 min，其編號(hào)設(shè)定為C1、C2、C3、C4 和C5，結(jié)果如表3 所示.

表3 不同煎煮時(shí)間對(duì)總生物堿含量的影響

由表3 可知，隨著煎煮時(shí)間由20 min 到60 min的逐漸增加，其提取的生物堿含量也呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì).在煎煮時(shí)間從20 min 增加到40 min的時(shí)間段內(nèi)，其生物堿含量呈現(xiàn)出逐漸增高的趨勢(shì)，即以煎煮40 min 的C3 溶出的生物堿量最多，為0.1469%;但當(dāng)煎煮時(shí)間進(jìn)一步增長(zhǎng)到C4 的50 min和C5 的60 min 時(shí)，其測(cè)得溶出的生物堿含量并沒有進(jìn)一步的增高，而卻呈現(xiàn)出了下降的趨勢(shì).這主要是因?yàn)樵谥兴幍募逯筮^程中，如煎煮時(shí)間過長(zhǎng)，則會(huì)破壞或散失掉藥物中的某些成分［9］.另外，卷葉貝母組培物材料中含有較多的淀粉粒，煎煮時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使得淀粉粒嚴(yán)重糊化，從而影響其生物堿的分離提取，但是如果藥材煎煮時(shí)間過短，藥材中的多數(shù)成分又不易完全溶出［10］.因此，選擇適宜的煎煮時(shí)間對(duì)提取藥材中的有效成分有重要意義.

3 討 論

中醫(yī)的湯劑已有數(shù)千年的歷史.由于湯劑能很好地滿足中醫(yī)辨證施治、隨證加減的需要，又具有吸收快、療效高的優(yōu)越性，故備受歷代醫(yī)家的推崇［11］.但患者普遍缺乏湯劑煎煮的基礎(chǔ)知識(shí)，常因湯劑煎煮不當(dāng)而影響了藥物的療效［12］.本實(shí)驗(yàn)著重研究了煎煮藥物材料的大小、浸泡時(shí)間和煎煮時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)藥物有效成分的溶出率的影響，以探尋一條合理規(guī)范的中藥煎煮方法.此不僅對(duì)節(jié)約原料、提高臨床療效有非常重要的意義，而且還對(duì)實(shí)現(xiàn)中醫(yī)現(xiàn)代化、標(biāo)準(zhǔn)化也有巨大的推動(dòng)作用.

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