萬壽菊內(nèi)生真菌WZ2菌株形態(tài)鑒定及生物學(xué)特性

魯海菊++施玉梅++潘柳君++王波++鄭肖蘭

摘要：萬壽菊（Tagetes erecta）植株含有噻吩類、萜類、醇類、酮類等具抗植物病蟲活性的化合物。從抗病植物中分離內(nèi)生真菌，進(jìn)而獲得抗病蟲活性化合物已成為生物防治的研究熱點(diǎn)之一。試驗(yàn)對分離自萬壽菊種子中的1株內(nèi)生真菌WZ2菌株進(jìn)行形態(tài)鑒定，并測定其生物學(xué)特性。經(jīng)顯微形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)分生孢子盤褐色，橢圓形或近圓形，（94.9～299.8） μm×（75.4～217.9） μm；剛毛淡褐色，直立，有隔膜，（158.8～174.9） μm×（8.4～9.7） μm；分生孢子淡褐色，橢圓形或近圓形，（8.8～14.8） μm×（7.4～8.8） μm。將其初步鑒定為炭疽菌屬的一種（Colletotrichum sp.）。生物學(xué)特性測定結(jié)果表明最適合其菌絲生長的培養(yǎng)條件為查氏培養(yǎng)基和胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基；麥芽糖為碳源、酵母膏為氮源、25～30 ℃、pH 10、全光照，其中，適合產(chǎn)孢的培養(yǎng)基為查氏培養(yǎng)基的氮源硝酸鈉替換為酵母膏。

關(guān)鍵詞：萬壽菊（Tagetes erecta）種子；內(nèi)生真菌；鑒定；生物學(xué)特性

中圖分類號：Q949.32；Q93-331；Q935 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號：0439-8114（2015）11-2606-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.012

Identification on WZ2 Strain of Endophytic Fungus from Tagetes erecta and Its Biological Characteristics

LU Hai-ju1，SHI Yu-mei1，PAN Liu-jun1，WANG Bo1，ZHEN Xiao-lan2

（1. Department of Life Science and Technology， Honghe College， Mengzi 661199， Yunnan，China；

2. Environment and Plant Protection Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Danzhou 571737，Hainan，China）

Abstract： The strain Tagetes erecta is a compound of thiophenes，terpene，alcohol and ketone，which had insect resistance activity. Strain WZ2 of endophytic fungus from marigold seed was identified by morphology and the biological characteristics were tested. The results showed that acervulus brown，ellipsoid or sub-globe，94.9 μm～299.8 μm×75.4 μm～217.9 μm. seta pale brown，erect，septate，158.8 μm～174.9 μm×8.4 μm～9.7 μm. Conidia pale brown，ellipsoid or sub-globe， 8.8 μm～14.8 μm×7.4 μm～8.8 μm. It was identified as Colletotrichum sp. by morphology. The best condition that suits the hyphae growth is the Czapek's medium and carrot dextrose agar medium， maltose as carbon source， yeast extract or ammonium sulfate as nitrogen source， 25-30 ℃， pH 10， full of light. The medium which is suitable for sporulation is nitrate nitrogen of Czapek's medium replaced by yeast extract.

Key words： marigold（Tagetes erecta） seed； endophytic fungus； identification； biological characteristics

萬壽菊（Tagetes erecta）又名臭芙蓉、萬壽燈、蜂窩菊、臭菊花、蝎子菊[1]，是菊科萬壽菊屬一年生草本花卉[1]。其花中的葉黃素色澤鮮艷、著色力強(qiáng)，安全無毒，廣泛用于食品、化妝品等產(chǎn)業(yè)，其植株含有噻吩類、萜類、醇類、酮類等抗植物病蟲活性的化合物[2]，經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高。植物內(nèi)生真菌（Endophytic fungi）是一類在健康植物組織內(nèi)定殖，但不引起病害癥狀的真菌[3]。它能提高宿主植物對生物脅迫的抗性[4]，還可通過宿主的種子進(jìn)行遺傳[5]。某些內(nèi)生菌在宿主植物衰老或受到環(huán)境脅迫時(shí)又會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)椴≡?，使寄主植物發(fā)病[6]。

2013年，云南省紅河州蒙自市鳴鷲鎮(zhèn)萬壽菊葉斑病暴發(fā)流行，發(fā)病率100%。經(jīng)分離鑒定，此病害由交鏈孢（Alternaria sp.）引起，疑似種子帶菌所致。出人所料的是，反復(fù)檢測其種子，未分離到交鏈孢，反而分離到1株生長非常緩慢的內(nèi)生真菌（WZ2）。目前有關(guān)萬壽菊內(nèi)生真菌的研究尚鮮有報(bào)道。此菌株是否會(huì)產(chǎn)生抗病活性的代謝產(chǎn)物，與其宿主種子之間存在何種生理關(guān)系，是否會(huì)演變?yōu)椴≡?，一系列問題有待深入研究。因此，本試驗(yàn)對萬壽菊內(nèi)生真菌WZ2菌株進(jìn)行形態(tài)及其生物學(xué)特性研究，為其后續(xù)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。endprint

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 WZ2菌株從蒙自市榮陽工貿(mào)有限公司送檢的萬壽菊種子中分離獲得。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 PDA（馬鈴薯200 g、葡萄糖16 g、瓊脂粉20 g、去離子水1 000 mL）、PSA（馬鈴薯200 g、蔗糖16 g、瓊脂粉 20 g、去離子水1 000 mL）、MA（玉米30 g、瓊脂粉20 g、去離子水1 000 mL）、WA（小麥30 g、瓊脂粉20 g、去離子水1 000 mL）、CA（胡蘿卜200 g、瓊脂粉20 g、去離子水1 000 mL）、Czapeks medium（硝酸鈉2.00 g、磷酸二氫鉀1.00 g、氯化鉀0.50 g、七水硫酸鎂0.50 g、硫酸鐵0.01 g、蔗糖30.00 g、瓊脂粉20 g、去離子水1 000 mL）。

1.1.3 試劑 碳源（葡萄糖、可溶性淀粉、麥芽糖、α-乳糖、鼠李碳、木糖醇、D-甘露醇）、氮源（酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、尿素、硫酸銨、硝酸銨、磷酸二氫銨）。上述材料均購自農(nóng)貿(mào)市場及試劑公司，試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 萬壽菊內(nèi)生真菌WZ2菌株形態(tài)鑒定 將試管斜面保存的WZ2菌株接種于用酵母膏替換硝酸鈉的查氏培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后，采用插片法用光學(xué)鏡顯微觀察孢子形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、菌絲顏色及橫隔等微觀特征鑒定其種屬[7]。

1.2.2 測定不同培養(yǎng)基對菌絲生長的影響 將WZ2菌株在PDA平板培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫?cái)U(kuò)大培養(yǎng)7 d，在培養(yǎng)基同一半徑周圍用打孔器取直徑為5 mm的菌絲塊，同時(shí)接種于PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂）、CM（Czapeks medium，查氏）、MA（玉米瓊脂）、WA（燕麥瓊脂）、CA（胡蘿卜瓊脂）培養(yǎng)基平板中央，設(shè)3次重復(fù)，25 ℃黑暗培養(yǎng)7 d，用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.3 測定碳、氮源對菌絲生長的影響 以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用相等質(zhì)量分?jǐn)?shù)的碳（可溶性淀粉、α-乳糖、麥芽糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖醇、D-甘露醇）和氮（硫酸銨、硝酸銨、磷酸二氫銨、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、尿素）替換蔗糖和硝酸鈉，接種及測量方法同步驟“1.2.2”。

1.2.4 測定溫度對菌絲生長的影響 以PDA為供試培養(yǎng)基，接種后分別在10、15、20、25、30、35和40 ℃下恒溫培養(yǎng)，接種及測量方法同步驟“1.2.2。

1.2.5 測定pH對菌絲生長的影響 以PDA為供試培養(yǎng)基，分別用0.1%鹽酸及0.1%氫氧化鈉將pH調(diào)至3、4、5、6、7、8、9和10，接種及測量方法同步驟“1.2.2”。

1.2.6 測定光照對菌絲生長的影響 以PDA為供試培養(yǎng)基，接種后分別在光暗交替（12 h光照，12 h黑暗）、全黑暗和全光照3種光處理下培養(yǎng)，接種及測量方法同步驟“1.2.2”。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件Duncan多重比較法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 萬壽菊內(nèi)生真菌WZ2菌株形態(tài)鑒定結(jié)果

孢子盤褐色，橢圓形或近圓形，（94.9～299.8） μm×（75.4～217.9） μm；剛毛淡褐色，直立，有隔膜，（158.8～174.9） μm×（8.4～9.7） μm；分生孢子淡褐色，橢圓形或近圓形，（8.8～14.8） μm×（7.4～8.8） μm。根據(jù)形態(tài)特征[8-12]（圖1），鑒定為炭疽菌屬的一種（Colletotrichum sp.）。

2.2 不同培養(yǎng)基對萬壽菊內(nèi)生真菌WZ2菌株菌絲生長的影響

由表1可知，萬壽菊內(nèi)生真菌WZ2菌株在供試的5種培養(yǎng)基上均能生長。其中，查氏及胡蘿卜兩種培養(yǎng)基與其余培養(yǎng)基相比，其菌絲生長差異極顯著，菌落直徑最大，說明查氏及胡蘿卜兩種培養(yǎng)基更適合其菌絲生長。而馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基最不適合其菌株菌絲生長。5種培養(yǎng)基中均無孢子產(chǎn)生，說明這5種培養(yǎng)基都不適合WZ2菌株產(chǎn)孢。

2.3 不同碳源對萬壽菊內(nèi)生真菌WZ2菌株菌絲生長的影響

由表2可知，鼠李糖、木糖醇、D-甘露醇3種碳源不能被WZ2菌株吸收利用，可溶性淀粉、α-乳糖、麥芽糖、葡萄糖4種碳源能被吸收利用。其中，麥芽糖與其余碳源差異極顯著，菌落直徑最大，說明麥芽糖最適合其菌絲生長。上述碳源中均不產(chǎn)孢，說明碳源不是影響產(chǎn)孢的因素。

2.4 不同氮源對萬壽菊內(nèi)生真菌WZ2菌株菌絲生長的影響

由表3可知，萬壽菊內(nèi)生真菌WZ2菌株在供試的7種氮源培養(yǎng)基中均能正常生長，具有較強(qiáng)的氮源適應(yīng)性。相比較而言，酵母膏中生長的菌絲菌落直徑較大，說明酵母膏最適合其菌絲生長，而且適合產(chǎn)孢，其余6種氮源中均不產(chǎn)孢。

2.5 不同溫度對萬壽菊內(nèi)生真菌WZ2菌株菌絲生長的影響

由表4可知，萬壽菊內(nèi)生真菌WZ2菌株在10～35 ℃范圍內(nèi)菌絲均能生長，25～30 ℃菌絲生長直徑與其余溫度差異極顯著，菌落直徑最大，說明25～30 ℃最適合其菌絲生長，不同的培養(yǎng)溫度下均無孢子產(chǎn)生，說明溫度不是影響產(chǎn)孢的因素。

2.6 不同pH對萬壽菊內(nèi)生真菌WZ2菌株菌絲生長的影響

由表5可知，萬壽菊內(nèi)生真菌WZ2菌株在不同pH培養(yǎng)基中生長差異極顯著，其中，pH 9～10菌落直徑最大，說明pH 9～10最適合其菌絲生長。pH 3～7菌絲生長明顯受到抑制。不同pH下均無孢子產(chǎn)生，說明pH不是影響產(chǎn)孢的因素。

2.7 光對萬壽菊內(nèi)生真菌WZ2菌株菌絲生長的影響

由表6可知，在光暗交替（12 h光照，12 h黑暗）、全黑暗和全光照3種光處理下，菌絲生長差異極顯著，其中，全光照處理菌落直徑最大，說明光照有利于其菌絲生長，不同光照條件下均無孢子產(chǎn)生，說明光不是影響產(chǎn)孢的因素。endprint

3 小結(jié)與討論

萬壽菊內(nèi)生真菌WZ2菌株初步鑒定為炭疽菌屬的一種（Colletotrichum sp.），其菌絲生長及產(chǎn)孢的培養(yǎng)條件為查氏培養(yǎng)基的氮源硝酸鈉替換為酵母膏、25～30 ℃、pH 9～10、全光照。何冬云等[8]在萬壽菊種子帶菌檢測過程中未分離到炭疽菌屬。本試驗(yàn)首次從萬壽菊種子中分離出炭疽菌屬（Colletotrichum）內(nèi)生真菌。刺五加[9]、印楝[10]、銀杏[11]、黃瓜[12]、棗樹[13]等宿主中也曾分離出炭疽菌屬內(nèi)生真菌，說明其廣泛分布于各種植物中。本試驗(yàn)分離出的WZ2菌株其適合生長及產(chǎn)孢的培養(yǎng)條件為查氏培養(yǎng)基的氮源硝酸鈉替換為酵母膏，25～30 ℃、pH 10、全光照。其他培養(yǎng)條件均不產(chǎn)孢。這與大多數(shù)炭疽菌菌株有差異。原因還有待進(jìn)一步研究。近年的研究表明特定的內(nèi)生真菌可能產(chǎn)生與宿主相類似的生理活性成分[14]，萬壽菊提取物具有殺菌[15-18]、殺線蟲[19]活性，其活性成分為黃酮[20]、精油[21]，其中，萬壽菊根乙酸乙酯提取物對細(xì)鏈格孢（Alternaria aternata）的抑制率達(dá)79.77%[16]。WZ2菌株是否能產(chǎn)生與萬壽菊相同或相似的生理活性物質(zhì)，能否抑制萬壽菊葉斑病菌（Alternaria sp.）還有待深入研究。另外，炭疽菌屬中廣泛存在著致病菌，此菌株從經(jīng)過嚴(yán)格消毒的種胚中分離獲得，在其宿主種子的生長發(fā)育期中會(huì)隨著生長傳播到根、莖、葉、花中，隨著環(huán)境條件的改變可能會(huì)激發(fā)它的致病性，但對這種作用的具體機(jī)制還不了解。因此，還有待于進(jìn)一步研究其與萬壽菊生長的關(guān)系。

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