牛奶子根多糖的抗氧化性與抑菌作用

吳　美，張　敏（福建省生態(tài)產(chǎn)業(yè)綠色技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建省高校綠色化工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武夷學(xué)院 生態(tài)與資源工程學(xué)院，福建 武夷山354300）

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牛奶子根多糖的抗氧化性與抑菌作用

吳美，張敏
（福建省生態(tài)產(chǎn)業(yè)綠色技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建省高校綠色化工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武夷學(xué)院 生態(tài)與資源工程學(xué)院，福建 武夷山354300）

摘要：利用水提醇沉法從牛奶仔根中提取多糖，再經(jīng)初步純化后，進(jìn)行多糖的抗氧化與抑菌作用實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，牛奶仔根多糖對(duì)DPPH和O2-·有較強(qiáng)的清除作用，最高清除率分別為（84.02±2.84）%和（72.09±5.24）%；對(duì)·OH的清除作用效果一般，最高清除率只有（44.2±2.72）%。牛奶仔根多糖對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均具有一定的抑制作用，對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制作用較為明顯。

關(guān)鍵詞：牛奶仔根；多糖；抗氧化性；抑菌作用

牛奶子 （Elaeagnus umbellata Thunb.），又名天仙果、半春子、羊奶子等[1]。牛奶子屬胡頹子屬，落葉灌木，是亞熱帶和溫帶地區(qū)的常見植物，牛奶子廣泛分布于長江流域，華北，華東地區(qū)，多生長在向陽的林緣、疏林和灌叢中、荒坡上、溝邊及河邊砂地[2-4]。具有藥用作用，其根入藥，具有補(bǔ)中益氣等功效，主治風(fēng)濕痹痛等，還可做烹制菜肴的調(diào)味品、保健品及作為觀賞品等多種利用價(jià)值，是一種價(jià)值利用豐富的經(jīng)濟(jì)植物[3]。據(jù)研究，就牛奶子根而言，就具有補(bǔ)中益氣，健脾化濕，行氣活血，止瀉，用于泄瀉，淋病，熱咳，跌打損傷，血崩，麻疹[5]。

目前，關(guān)于牛奶子的研究，主要集中于其生態(tài)學(xué)習(xí)性，果實(shí)性狀及營養(yǎng)成分的產(chǎn)地與株間變異研究[6]、組織培養(yǎng)[7]、藥用成分分離與測定[8]和牛奶子葉子、枝條、種子中多糖抗氧化活性的研究[9]等等，而對(duì)于牛奶子根多糖研究報(bào)道很少。

本試驗(yàn)采用Fenton反應(yīng)法[11]測定牛奶仔根多糖對(duì)·OH的清除作用，利用DPPH·乙醇溶液顯色[9]測定牛奶仔根多糖對(duì)DPPH的清除作用，采用鄰苯三酚自氧化法[12]測定牛奶仔根多糖對(duì)O2-·的清除作用；通過濾紙片擴(kuò)散法[13]測定牛奶子根多糖對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等的抑菌效果研究，旨在為牛奶子植物資源的深入研究提供理論指導(dǎo)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

牛奶子根于2014年購自福建省建甌市。將購回的牛奶子根先用流水沖凈泥土，后用蒸餾水清洗干凈，60℃烘干至恒重，粉碎，過40目篩，待用。

細(xì)菌：枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌由武夷學(xué)院生態(tài)與資源工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

無水乙醇、三氯甲烷、硫酸亞鐵、水楊酸、30%雙氧水、正丁醇、鹽酸、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、1,1-二苯基苦基苯肼自由基（DPPH）等均為分析純，水為重蒸水。

1.2儀器與設(shè)備

低速離心機(jī)：安徽中科佳科學(xué)儀器有限公司；高速離心機(jī)：上海力申科學(xué)儀器有限公司；立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器：致微（廈門）儀器有限公司；生化培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申上科技有限公司；紫外可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；循環(huán)水真空泵：開封市宏興科教儀器廠；電熱恒溫水浴鍋：上海精宏設(shè)備有限公司；SW-CJ-2FD型單面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司等。

1.3方法

1.3.1牛奶仔根多糖樣品的制備

牛奶仔根粉末用40倍水95℃水浴浸提30 min，重復(fù)3次，抽濾將提取液與殘?jiān)蛛x，提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至一定體積，加入1/4體積的 Savage試劑，強(qiáng)烈振搖30 min。靜置過夜后分層，離心除去交界處變性蛋白，重復(fù)處理3次脫蛋白，再加入3倍體積的95%的乙醇，4℃醇沉過夜，離心，沉淀物60℃烘干至恒重得牛奶仔根粗多糖。

1.3.2牛奶仔根多糖的抗氧化能力實(shí)驗(yàn)

（1）清除OH能力的測定利用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生·OH，·OH氧化水楊酸產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在510 nm處有強(qiáng)吸收峰。體系中加入清除·OH的物質(zhì)，則會(huì)減少有色物質(zhì)生成，降低吸光度[11]。稱取牛奶子根粗多糖粉末0.1 g，用蒸餾水配制成1 mg/mL母液，并進(jìn)行梯度稀釋，配制濃度為0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL溶液，取若干支25 mL比色管，分別加入9 mmol/L FeSO40.25 mL、9.0 mmol/L水楊酸-乙醇溶液0.25 mL，以上不同質(zhì)量濃度的牛奶仔根多糖溶液5 mL，最后加入8.8 mmol/L H2O20.25 mL啟動(dòng)反應(yīng)，于室溫下反應(yīng)1 h[15]。試驗(yàn)設(shè)一個(gè)樣品組和兩個(gè)對(duì)照組，對(duì)照組1中用蒸餾水代替樣品，對(duì)照組2用蒸餾水代替顯色劑[10]。計(jì)算多糖對(duì)·OH的清除率。

清除率=[1-（Ai-A2）/A1]×100%]

式中：A1是對(duì)照組1的吸光度；Ai為樣品組吸光度；A2為對(duì)照組2的吸光度。

（2）清除DPPH的能力的測定 利用DPPH·乙醇溶液在517 nm波長處有特征吸收峰，加入抗氧化劑后，在517 nm波長處吸光度的下降表示抗氧化劑對(duì)DPPH的清除能力[9]。準(zhǔn)確稱取0.010 0 g DPPH溶解在無水乙醇中，用250 mL棕色容量瓶定容，放入冰箱中備用。將牛奶子根多糖樣品配制成濃度分別為0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL的牛奶子根多糖溶液。在2 mL的DPPH醇溶液中加入2 mL樣品溶液，混勻避光30 min。按（1）節(jié)計(jì)算方法計(jì)算清除率。采用鄰苯三酚自氧化法[12]，在10 mL試管中加入3 mLTris-HCl緩沖液（pH= 8.2），分別加入1 mL濃度為0.01 mg/mL、0.05 mg/mL、0.2 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL的牛奶仔根多糖溶液，（25±0.5）℃水浴平衡20 min后，加入0.3 mL7.0 mmol/L的鄰苯三酚準(zhǔn)確反應(yīng)4 min，加入1 mL 10.0 mol/LHCl終止反應(yīng)，在420 nm處測定其吸光度A[15]。按（1）節(jié)計(jì)算方法計(jì)算清除率。

1.3.3牛奶仔根多糖的抑菌實(shí)驗(yàn)

（3）清除o2能力的測定預(yù)先將枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌菌種分別接入相應(yīng)的斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行活化。然后分別挑取1環(huán)已經(jīng)活化好的菌種放入無菌水中，振蕩搖勻，調(diào)整菌濃度約為105～107CFU/mL，備用。

（1）供試菌種的活化及菌懸液的制備采用濾紙片法[13]。濾紙打成直徑為6 mm的小紙片，121℃濕熱滅菌20 min。粗多糖用蒸餾水配成0.05、0.1、0.2、0.5、1 mg/mL等一系列濃度的溶液，在試驗(yàn)前用微孔過濾器（0.45 μm）除菌。將制好的濾紙片無菌狀態(tài)下于各濃度牛奶仔根多糖溶液中浸泡30 min備用。同法用無菌水做陰性對(duì)照。

倒入細(xì)菌的固體培養(yǎng)基，待其完全凝固后，再分別移取各菌懸液0.2 mL，用涂布棒涂布均勻。每個(gè)平板放各溶液浸泡過的濾紙片3片（空白用無菌水浸泡過的濾紙片），用無菌鑷子取樣片貼放于平板表面。各樣片中心之間間距30 mm以上，與平板的周緣相距15 mm以上。貼好后用無菌鑷子輕壓樣片，使其緊貼于平板面上，蓋好平皿，倒置，37℃恒溫培養(yǎng)過夜。

（2）抑菌活性的測定

2　結(jié)果與分析

2.1抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1牛奶仔根多糖對(duì)·OH清除作用的測定測定牛奶仔根多糖對(duì)·OH的清除能力，以相應(yīng)濃度的Vc對(duì)照，試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1　牛奶仔根多糖與Vc對(duì)·OH的清除作用的比較

由圖1可知，在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度為0.05～0.1 mg/mL范圍時(shí)，對(duì)照品Vc對(duì)·OH的清除作用呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，在Vc濃度大于0.1 mg/mL時(shí)，Vc對(duì)·OH的清除作用大于99%，表明Vc對(duì)·OH具有較強(qiáng)的清除作用。而牛奶仔根多糖對(duì)·OH的清除作用一般，在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，對(duì)·OH的清除率為44.2%。

2.1.2牛奶仔根多糖對(duì)DPPH清除作用的測定

測定牛奶仔根多糖和Vc對(duì)DPPH的清除能力，試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2　牛奶仔根多糖和Vc對(duì)DPPH的清除作用的比較

圖2表明，Vc溶液在研究濃度范圍內(nèi)對(duì)DPPH的清除程度均在95%左右，無明顯變化。在0.2～1.0 mg/mL之間，隨著牛奶仔根多糖濃度的提高對(duì)DPPH的清除作用也逐漸加強(qiáng)，呈現(xiàn)量效關(guān)系，多糖濃度達(dá)到0.6 mg/mL以上時(shí)，清除率已經(jīng)超過60%，當(dāng)多糖濃度上升到1 mg/mL時(shí)，清除率可達(dá)84.02%。

2.1.3牛奶仔根多糖對(duì)O2-·清除作用的測定 測定牛奶仔根多糖和Vc對(duì)O2-·的清除能力，試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3　牛奶仔根多糖對(duì)與Vc對(duì)O2-·清除作用的比較

由圖3可知，在濃度小于0.05 mg/mL時(shí)，牛奶仔根多糖比對(duì)照品Vc對(duì)O2-·的清除作用具有更明顯的清除作用，牛奶仔根多糖在濃度為0.01 mg/mL，清除率即達(dá)到43.56%，在多糖濃度為0.5 mg/mL時(shí)清除率可達(dá)72.09%。

2.2牛奶仔根多糖的抑菌活性

由濾紙片擴(kuò)散法測定抑菌活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1　牛奶仔根多糖對(duì)各菌種的抑菌圈直徑

由表1可知，牛奶仔根多糖提取液對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均具有一定的抑菌效果。當(dāng)牛奶仔根多糖提取液濃度在0.05～0.1 mg/mL范圍時(shí)，只對(duì)枯草芽孢桿菌具有一定的抑菌效果，而對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌無明顯抑制作用；當(dāng)多糖濃度大于0.2 mg/mL時(shí)，對(duì)三種細(xì)菌均具有一定的抑制作用，抑制效果為：枯草芽孢桿菌＞金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌。

3　結(jié)語

自由基是需氧生物生命活動(dòng)過程中多種生化反應(yīng)的中間代謝產(chǎn)物。當(dāng)其產(chǎn)生過量或清楚過慢時(shí)，會(huì)造成生物體的各種損傷。由試驗(yàn)結(jié)果可知，牛奶子根多糖清除效果雖弱于Vc，但對(duì)自由基還是具有明顯的清除能力。牛奶子根多糖在體外對(duì)·OH、DPPH、O2-·均具有一定的清除作用。在牛奶仔根多糖濃度為1.0 mg/mL時(shí)，對(duì)·OH、DPPH的清除率分別為44.2%、84.02%，濃度為0.5 mg/mL時(shí)，對(duì)O2-·的清除率為72.09%，可見清除DPPH、O2-·的能力強(qiáng)于清除·OH的能力。因此牛奶子根多糖能夠有效清除自由基，阻斷自由基反應(yīng)鏈，具有一定的抗氧化和防衰老的作用，可作為清除人體系統(tǒng)內(nèi)自由基的抗氧化物[14]。

多糖對(duì)于各類微生物的生長的作用機(jī)制目前尚不明確。試驗(yàn)表明，牛奶仔根多糖對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有較為良好的體外抑菌活性，并表示出一定的劑量依賴關(guān)系。牛奶仔根多糖溶液濃度在0.05～0.1 mg/mL時(shí)，對(duì)枯草芽孢桿菌具有明顯的抑制作用，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌作用不明顯；但當(dāng)多糖濃度大于0.2 mg/mL時(shí)，對(duì)枯草芽孢桿菌等三種細(xì)菌均具有一定的抑制作用，抑制效果為：枯草芽孢桿菌＞金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌。

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中圖分類號(hào)：Q949.761.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1674-2109（2015）06-0035-04

收稿日期：2015-04-17

基金項(xiàng)目：福建省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（201310397026）。

作者簡介：吳美（1991-），女，漢族，在讀本科生，主要研究方向：生物工程。

通訊作者：張敏（1972-），男，漢族，講師，主要研究方向：化工新材料。

Antioxidant and Antimicrobial Activities of Elaeagnus umbellata Thunb.Polysaccharides

WU Mei，ZHANG Min
（Fujian Provincial Key Laboratory of Eco-Industrial Green Technology,Fujian Higher Education Institutions Key Laboratory of Green Chemistry and Technology,School of Ecology and Resource Engineering，Wuyi University,Wuyishan，F(xiàn)ujian 354300）

Abstract：Polysaccharide in Elaeagnus umbellata Thunb.was extracted by water extraction and ethanol precipitation in this study.The polysaccharide was further purified and its antioxidant and antimicrobial activities were investigated.The results showed that the polysaccharide from Elaeagnus umbellata Thunb.could significantly decrease the DPPH and superoxide anion radical.The decreasing rate of DPPH and superoxide anion radical could arrived at（84.02±2.84）%and（72.09±5.24）%respectively.However,the polysaccharide had little scavenging effect on·OH and the decreasing rate could arrived at（44.2±2.72）%.Furthermore,it was found that the polysaccharide could inhibit the growth of Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus and Escherichia coli.And the inhibitory effect on Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus was more significant than that on Escherichia coli.

Key words：Elaeagnus umbellata Thunb；polysaccharide；antioxidant activity；antimicrobial activity