木瓜蛋白酶提取蛇皮膠原蛋白的工藝研究

吳玉瓊，駱紅霞，胡永樂，張　靜，溫愛國（.武夷學(xué)院 茶與食品學(xué)院，福建 武夷山 354300；.武夷山蛇類研究所，福建 武夷山 354300）

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木瓜蛋白酶提取蛇皮膠原蛋白的工藝研究

吳玉瓊1，駱紅霞1，胡永樂1，張靜1，溫愛國2
（1.武夷學(xué)院 茶與食品學(xué)院，福建 武夷山 354300；2.武夷山蛇類研究所，福建 武夷山 354300）

摘要：采用木瓜蛋白酶從人工養(yǎng)殖的蛇皮中提取膠原蛋白，研究了提取液的pH值、酶濃度、溫度、固液比和提取時間對膠原蛋白提取率的影響。結(jié)果表明，木瓜蛋白酶提取蛇皮中膠原蛋白的最佳工藝為：提取溫度30℃，提取劑檸檬酸，木瓜蛋白酶濃度3.00%、固液比1:10、pH值6、提取時間24 h，在此條件下膠原蛋白提取率為89.30%。

關(guān)鍵詞：蛇皮；膠原蛋白；木瓜蛋白酶；最佳參數(shù)

膠原蛋白是一種白色、不透明、無支鏈的纖維蛋白質(zhì)，是由動物細(xì)胞合成的一種生物性高分子，廣泛存在于動物的骨、腱、肌鞘、韌帶、肌膜、軟骨和皮膚中，是結(jié)締組織中極其重要的一種蛋白質(zhì)，具有重要的生物學(xué)性質(zhì)和較好的力學(xué)性能，具有良好的生物相容性和可生物降解性，還具有促進(jìn)細(xì)胞生長的特性[1-3]。

研究表明膠原蛋白的應(yīng)用極為廣泛，主要有臨床醫(yī)學(xué)有促進(jìn)細(xì)胞的損傷修復(fù)和細(xì)胞生長[4-9]，生物發(fā)酵中作為一種新型的生物發(fā)酵培養(yǎng)基[10]，在食品中的應(yīng)用于功能性食品、肉制品改良劑、食品包裝材料等[11-13]。

膠原蛋白的提取一般集中于膠原蛋白較為豐富的組織，例如皮膚和肌腱。膠原的提取除了傳統(tǒng)的來源一一一牛、豬、羊，還拓展到許多其他的資源，例如人的胎盤[14]、海洋生物[15]，甚至是利用基因生物技術(shù)從轉(zhuǎn)基因動物獲取重組人膠原蛋白[16-17]。

我國蛇資源豐富，由于蛇皮外觀的花紋清晰艷麗，圖案獨(dú)特，經(jīng)制革工藝處理后，用來制作各種精美別致的工藝品，或可用來制作樂器的琴膜和鼓皮。但由于蛇皮工藝技術(shù)的落后，在加工過程中，產(chǎn)生了大量下腳料，約占完整蛇皮的20%～30%，如果不進(jìn)行有效處理，不僅污染環(huán)境，還浪費(fèi)大量的原料。蛇皮中含有大量的膠原蛋白，當(dāng)前，以魚鱗、各類動物皮制備的一系列膠原產(chǎn)品已具有廣闊的應(yīng)用領(lǐng)域，橫跨化工業(yè)、食品行業(yè)、化妝品業(yè)、醫(yī)藥業(yè)，可見以蛇皮制備膠原的系列產(chǎn)品的開發(fā)也有著美好的前景。

武夷山素有“蛇的王國”之美譽(yù)，不僅因?yàn)槠渚哂卸喾N多樣的生態(tài)環(huán)境，為蛇的棲息、繁衍提供了適宜的條件，還因武夷山蛇類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展廣泛，僅市區(qū)周邊的蛇類養(yǎng)殖戶就有數(shù)十家，養(yǎng)殖基地面積達(dá)300 m2。據(jù)調(diào)查，本地每年產(chǎn)蛇量可達(dá)100 t，其中10%為蛇皮，用于工藝品加工后被廢棄的副產(chǎn)物達(dá)3%，可見綜合開發(fā)利用武夷山菜蛇資源是促進(jìn)蛇類養(yǎng)殖業(yè)長足發(fā)展的趨勢。

本文采用木瓜蛋白酶，以武夷山人工養(yǎng)殖的王錦蛇（Elaphe carinata）、赤鏈蛇（Dinodon rufozonatum）等蛇皮為原料，探討了蛇皮中膠原蛋白的提取工藝，確定了酶法從蛇皮工藝下腳料中提取膠原蛋白的最佳工藝條件，以制備高附加值、市場前景廣闊的膠原蛋白，從而變廢為寶，實(shí)現(xiàn)廢物利用。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1主要材料

蛇皮：由武夷山蛇博園提供。

1.1.2主要試劑

木瓜蛋白酶（上海沃凱藥業(yè)有限公司）

L-羥脯氨酸（上海沃凱藥業(yè)有限公司）

對二甲氨基苯甲醛（Sigma公司）

氯胺T（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）

1.1.3主要儀器

UV-1800型紫外可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）

FW100高速萬能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）

TG16K-Ⅱ高速離心機(jī) （長沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1蛇皮預(yù)處理

蛇皮分離→色素等可溶性雜質(zhì)的去除→烘干→破碎→脂肪去除→雜蛋白去除→烘干

1.2.2操作要點(diǎn)

（1）分離

對蛇皮的處理需將蛇肉與蛇皮徹底分開，避免蛇肉蛋白影響結(jié)果。

（2）色素等可溶性雜質(zhì)的去除

使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的Na2CO3溶液清洗蛇皮，去除色素等可溶性雜質(zhì)，再以清水洗滌至pH為中性[18]。

（3）破碎

剪切成約0.5cm×0.5 cm的碎片，30℃烘干，用高速組織搗碎機(jī)搗碎。

（4）脂肪的去除

取上述處理過的碎蛇皮，按1∶20（體積質(zhì)量比）用1:1無水乙醚+石油醚浸泡0.5 h，振蕩處理2 h[19]。6 000 r/min離心15 min，去上清液，得沉淀，置于通風(fēng)處讓無水乙醚和石油醚揮發(fā)，晾干，待用。

（5）雜蛋白的去除

取上述處理過的蛇皮，按1∶16（體積質(zhì)量比）加入4%NaCl溶液，振蕩處理2 h，再浸提6 h[19,20]。6 000 r/min離心15 min，去上清液，得沉淀，用清水清洗，30℃烘干至恒量，備用。

1.2.3蛇皮膠原蛋白酶法提取

稱取適量經(jīng)預(yù)處理的蛇皮，在最適pH值條件下加入適量體積的檸檬酸（0.1 mol/L）提取液[19]，加入適量木瓜蛋白酶，振蕩，一定溫度下，酶解一定時間。提取結(jié)束后，95℃滅酶10 min[21]，6000 r/min離心15 min，收集上清液，即可得到粗提膠原蛋白溶液，于-18℃冰箱保存?zhèn)溆肹19,20]。

1.2.4膠原蛋白提取率測定

按GB/T 96925.23-2008《肉與肉制品羥脯氨酸含量測定》測定羥脯氨酸含量，乘以相應(yīng)系數(shù)而得膠原蛋白的含量[22]。采用水生動物系數(shù)11.1換算[23]。

1.2.5試驗(yàn)方案

（1）單因素實(shí)驗(yàn)

試驗(yàn)以膠原蛋白的提取率為目標(biāo)參數(shù)，分別研究溫度、pH、固液比、酶濃度、提取時間5個單因素對提取率的影響。

（2）正交實(shí)驗(yàn)

經(jīng)單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)檸檬酸為提取溶劑，選取酶解時溶液pH值（A）、固液比（B）、酶濃度（C）、提取時間（D）作為主要參考因素，以干燥后得率為考查指標(biāo)，采用正交表L9（34）進(jìn)行4因素、3水平正交試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平見表1。

表1　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

2　結(jié)果與討論

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1提取溫度對蛇皮膠原蛋白提取率的影響

由圖1可知，當(dāng)酶濃度、提取時間、pH和料液比一定時，隨著溫度的升高，膠原蛋白的得率逐漸增加。在30℃時，達(dá)到最高值，得率為87.44%。隨著溫度的繼續(xù)升高，得率開始呈現(xiàn)下降趨勢。40℃時，膠原蛋白的得率降為77.31%，下降幅度較大?？梢姡?dāng)其他因素一定時，提取溫度對膠原蛋白提取率的影響較大，蛇皮中膠原蛋白的最佳提取溫度在30℃左右。溫度太低，木瓜蛋白酶無法發(fā)揮最佳作用，膠原蛋白酶解不完全。溫度太高，膠原蛋白易變性分解。

圖1　　提取溫度對蛇皮膠原蛋白提取率的影響

2.1.2不同pH值對蛇皮膠原蛋白提取率的影響

由圖2可知，當(dāng)料液比、提取時間、溫度、酶濃度一定時，隨著pH的增加，得率呈先增加后減少趨勢。在pH 6.0～7.0，得率較高，是由于在此pH范圍內(nèi)分子內(nèi)電荷達(dá)到了平衡狀態(tài)，提高了膠原蛋白的溶解速度。可見當(dāng)其他因素一定僅分析pH對膠原蛋白提取率的影響，可知酶解溶液pH為6時效果最佳。由此也可知pH對酶水解活力的影響較大，但在膠原蛋白提取實(shí)際應(yīng)用中還受其他因素的影響。

圖2　不同pH值對蛇皮膠原蛋白提取率的影響

2.1.3不同固液比對蛇皮膠原蛋白提取率的影響

由圖3可知，當(dāng)提取溫度、酶濃度、提取時間及pH一定時，隨著固液比的逐漸增大，膠原蛋白的得率變化忽高忽低，但總體而言差異不明顯，均為70%左右。可見，固液比對蛇皮中膠原蛋白提取率影響較小，可能是因?yàn)樘崛∪軇┑捏w積對酶活力的影響較小。再者考慮到成本和提取后廢液處理等因素，最后確定只需將蛇皮完全浸沒，固液比以1∶10即可。

圖3　　不同固液比對蛇皮膠原蛋白提取率的影響

2.1.4不同酶濃度對蛇皮膠原蛋白提取率的影響

在最適溫度下，相同固液比、提取時間、pH值條件下，不同酶濃度所測得的膠原蛋白提取率如圖4所示。隨著酶濃度的不斷上升，提取率越來越高，當(dāng)酶濃度增加至3.0%時提取率上升至最高，但升高趨勢較平緩。

圖4　　不同酶濃度對蛇皮膠原蛋白提取率的影響

2.1.5不同提取時間對蛇皮膠原蛋白提取率的影響

由圖5可知，當(dāng)固液比、提取溫度、pH和酶濃度一定時，得率在提取時間為24 h時達(dá)到最高點(diǎn)，為98.76%。32 h時得率為96.55%，呈現(xiàn)下降的趨勢?？梢?，提取時間過短，膠原蛋白酶解不徹底，產(chǎn)物少；時間過長，膠原蛋白部分發(fā)生水解，影響提取得率。

圖5　　不同提取時間對蛇皮膠原蛋白提取率的影響

2.2正交實(shí)驗(yàn)

由極差分析結(jié)果可知，各因素對膠原蛋白提取率影響程度依次為：pH值＞酶濃度＞固液比≈提取時間。木瓜蛋白酶提取蛇皮中膠原蛋白最佳因素水平組合為A1C3B2D2，即pH值6，酶濃度3.00%，提取時間為24h，固液比為1∶10。在此條件下得膠原蛋白的提取率為89.30%（見表2）。經(jīng)重復(fù)驗(yàn)證，該方案可行。

表2　　正交試驗(yàn)結(jié)果分析

3　結(jié)論

本試驗(yàn)重點(diǎn)研究了木瓜蛋白酶提取蛇皮膠原蛋白的影響因素，對最佳工藝條件進(jìn)行了分析，結(jié)果表明：木瓜蛋白酶提取蛇皮膠原蛋白的適宜工藝條件為提取溫度30℃、pH值6、酶濃度3.0%、固液比1∶10、提取時間24 h。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉學(xué)旭,王坤余,丁運(yùn)萍,等.膠原-葡甘聚糖-硫酸軟骨素復(fù)合膜對全層皮膚損傷修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志,2005（5）:1004-1010.

[2]唐傳核,彭志英.膠原的開發(fā)及利用[J].肉類研究,2000（3）: 41-43.

[3]王學(xué)川,任龍芳,強(qiáng)濤濤,等.膠原蛋白的研究進(jìn)展及其在化妝品中的應(yīng)用[J].日用化學(xué)工業(yè),2005（6）:388-391.

[4]Kremer M,Lang E,Berger A.Organotypical engineering of differentiatedcomposite-skinequivalentsofhuman keratinocytes in a collagen-GAG matrix（intergra artificialskin）in aperfu-sion culture system[J].Langenbec-ks Arch Surg, 2001,386（5）:357-363.

[5]Maruyara S,Nonaka I,Tannka H.Inhibitory effects of enzymatic hydrolysates of collagen and collagen-related synthetic petides on fibrinogen/thrombinclotting[J].Biochim biophys Acta,1993,1164（2）:215-223.

[6]趙利,蘇偉,胡火根,等.膠原蛋白生物活性肽的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2005（9）:578-582.

[7]周立珍,陳玲,李琳,等.膠原蛋白的制備及用作生物醫(yī)用材料的研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2004（12）:761-763.

[8]Friess W.Collagen-biomaterial for drug delivery[J].Eur J Pharm Biopharm,1998（2）:113-136.

[9]Willoughby CE,Batterbury M,Kaye SB.Collagen corneal shields[J].Surv Opthalmol,2002（2）:174-182.

[10]肖玉良,鄭連英,韓俊芬,等.膠原蛋白研究進(jìn)展[J].泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2005（5）:493-496.

[11]張心如.膠原蛋白食品倍受青睞[J].中國保健營養(yǎng),2003（7）:32.

[12]Gaston Torrescano,Armida Sanchez-Escalante.Shear values ofrawsamplesof14bovinemusclesandtheirrelationtomuscle collagencharacterist ics[J].MeatScience，2003（1）：85-91.

[13]Schilling M W,Mink L E,Gochenour P S,et al.Utilization of pork collagen for functionality improvement of boneless cured ham manufactured from pale,soft,and exudative pork [J].Meat Science,2003（1）:547-553.

[14]Spira M,Liu B,Xu Z,et al.Human amnion collagen for soft tissueaugmentation-biochemicalcharacterizationand animal observations.[J]Biomed.Mater.Res.1994（28）:91-96.

[15]PiezKA.Molecularandaggregatestructuresofthe collagens,in:K.A.Piez,A.H.Reddi（Eds.）,Extracellular Matrix Biochemistry,Elserier,New York,1984:1-40.

[16]米鈺,代菊紅,范代娣,等.重組類人膠原蛋白I的層析分離[J].西北大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2005（6）:737-740.

[17]Berg R A.Human collagen or procollagen production from milk produced by non-human mammal transformed with appropriateexpressionsystemprovideshomogeneous produce for therapautic use.PCT WO,1994（94）:16570.

[18]付強(qiáng),李國英,許燕,等.天然膠原高提取率的皮預(yù)處理方法的研究[J].中國皮革,2006（1）:28-35.

[19] 刁雪洋.豬皮膠原蛋白的提取及理化特性研究[D].重慶:西南大學(xué),2010.

[20]李小勇.豬肺中膠原蛋白的提取及理化特性研究[D].重慶:西南大學(xué),2007.

[21] 李紅方,王飛飛,李作衛(wèi)，等.白鰱魚鱗膠原蛋白提取工藝條件優(yōu)化研究[J].中國釀造，2012（8）:58-60.

[22]Nagai T,Araki Y,Suzuki N.Collagen of the skin of ocellate pufferfish（Takifugu rubripes）[J].Food Chemistry,2002（78）: 173-177.

[23]Sitthipong NaIinanon，Soottawat Benjakul，Wonnop Visessanguan,et al.Use of pepsin for collagen extraction from the skin of bigeye snapper（priacanthus tayenus）[J].Food Chemistry,2007（04）:593-601.

中圖分類號:TS255.36

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1674-2109（2015）06-0026-05

收稿日期：2015-03-15

基金項(xiàng)目：福建省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目（2012Y0063）。

作者簡介：吳玉瓊（1973-），女，漢族，副教授，主要研究方向：食品營養(yǎng)、食品工藝。

Research Process on the Extraction of Collagen with Papain from the Skin of Snake

WU Yuqiong1，LUO Hongxia1，HU Yongle1，ZHANG Jing1，WEN Aiguo2
（1.School of Tea and Food Science,Wuyi University,Wuyishan Fujian 354300; 2.Wuyishan Snakes Research Institute,Wuyishan，F(xiàn)ujian 354300）

Abstract:Collagen of extraction was studied from the farmed snake skin.The extraction technology including pH,papain concentration, immersion temperature,solid-liquid,immersion time was discussed.The results indicated that the optimum extracted conditions are as follows:at 30℃,in 0.1 mol/L citric acid buffer solution,the added enzyme dosage is 3.00%and the weight ratio of skin to solvent is 1 to 10,immersion time is 24 h.the recovery of the collagens was 89.30%.

Key words:snake skin;collagen;papain;optimal parameters