紫外分光光度法測(cè)定食用玫瑰花中類黃酮的含量

李絢，龍敏儀（肇慶市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東肇慶526020）

紫外分光光度法測(cè)定食用玫瑰花中類黃酮的含量

李絢，龍敏儀
（肇慶市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東肇慶526020）

摘要：建立紫外分光光度法測(cè)定食用玫瑰花中類黃酮含量的方法。在420 nm波長處有最大吸收峰，在50 mg/L～600 mg/L濃度范圍內(nèi)，吸光度與樣品濃度之間呈現(xiàn)良好的線形關(guān)系，回歸方程為Y=0.051 7+0.000 7x，相關(guān)系數(shù)r2= 0.999 98，檢出限為2.0 mg/kg；回收率在95.43%～104.67%之間，變異系數(shù)在0.86%～2.57%。

關(guān)鍵詞：食用玫瑰花；類黃酮；紫外分光光度法

玫瑰花食用是我國飲食文化的一大特色傳統(tǒng)，歷史悠久，明代盧和在《食物本草》中記載：“玫瑰花食之芳香甘美，令人神爽”。玫瑰花具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值，富含多種維生素、礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)、氨基酸和多種微量元素，以及色素、有機(jī)酸、酯類和膳食纖維，對(duì)人體有良好的食療保健功能。目前，現(xiàn)有的玫瑰花產(chǎn)品大都只是經(jīng)過簡(jiǎn)單加工而成，對(duì)其營養(yǎng)價(jià)值、功能因子很少做出評(píng)價(jià)[1-3]。

食用玫瑰花的化學(xué)成分研究己有不少研究報(bào)道，主要集中在揮發(fā)油成分和其它次生代謝產(chǎn)物方面，較少的文章是對(duì)玫瑰花抗氧化活性成分進(jìn)行研究，尤其是抗氧化成分類黃酮的研究幾乎都是空白[2-4]。為此，為促進(jìn)食用玫瑰花產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展，本文以食用玫瑰花為研究對(duì)象，選用蘆丁為類黃酮對(duì)照品，建立紫外分光光度法測(cè)定食用玫瑰花中類黃酮的方法，為食用玫瑰花綜合開發(fā)利用提供理論參考。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

玫瑰花，市場(chǎng)采購，烘干磨碎后備用。

1.2儀器與試劑

XPE型電子分析天平：梅特勒-托利多公司；T6型紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；RE-5003型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鄭州市亞榮儀器有限公司；Avanti J型高速離心機(jī)：貝克曼公司；HH-60型恒溫循環(huán)水箱：上海璽袁科學(xué)儀器有限公司；SH-B型恒溫?cái)嚢柩h(huán)水浴鍋：臺(tái)灣思派克電子（東莞）有限公司；PHS-2S型酸度計(jì)：上海雷磁；RHW-80型酒精度計(jì)：上海精密儀器儀表有限公司；WZS5型手持糖量計(jì)：上海物光手持糖量計(jì)；SFSP5660型錘片式粉碎機(jī)：石家莊華亞飼料機(jī)械有限公司；co2型恒溫培養(yǎng)箱：河北春機(jī)機(jī)械設(shè)備有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9920A型）：上海光學(xué)儀器廠。

蘆丁（純度≥99%）：成都藥品生物制品有限公司；石油醚（30℃～60℃）、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、無水乙醇、甲醇、冰乙酸（均為分析純）：廣東省汕頭市西隴化工廠；氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁，均為分析純：廣州化學(xué)試劑廠。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液：200 μg/mL，準(zhǔn)確稱取干燥恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20.0 mg（精度0.1 mg），置于100 mL容量瓶中，加適量甲醇溶解后定容至刻度，4℃保存。

1.3類黃酮的提取

準(zhǔn)確稱取食用玫瑰花樣品3 g（精度0.1 mg），經(jīng)50 mL石油醚除去脂肪后，加70%乙醇水溶液100 mL，80℃回流萃取，收集萃取液。如上反復(fù)萃取2次，將3次萃取液合并，減壓濃縮，甲醇溶解后定容至500 mL，過濾備用待測(cè)[2-3]。

1.4測(cè)定方法

準(zhǔn)確吸取一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液或待測(cè)樣溶液，置于10 mL比色管中，分別加甲醇至定容5 mL，再加0.5 mL的5%NaNO2溶液，搖勻后靜置5 min，加入0.5 mL的10%Al（NO3）3溶液，混勻后靜置5 min后加入4 mL的4%NaOH溶液，靜置10 min～20 min后用紫外可見分光光度計(jì)下比色，檢測(cè)波長為420 nm，記錄數(shù)據(jù)。樣品空白：吸取相同體積的待測(cè)樣溶液，置于10 mL比色管中，加甲醇定容至5 mL，加水1 mL，再加入4 mL的4%NaOH溶液，備用待測(cè)。

1.5檢測(cè)波長的選擇

依次吸取一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和待測(cè)樣品溶液依照1.4測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)試，在370 nm～600 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行最大吸收峰波長的選擇掃描。

1.6標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（200 μg/mL）0、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0 mL，依次置于10 mL比色管中，余下按照1.4和1.5中方法進(jìn)行測(cè)試，依據(jù)檢測(cè)的數(shù)據(jù)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性回歸方程，繪制以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

1.7結(jié)果計(jì)算

采用1.4和1.5中的方法，測(cè)定待測(cè)溶液的吸光度值（A），并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線圖查出待測(cè)液中類黃酮的濃度，具體按照下列公式計(jì)算食用玫瑰花中類黃酮的含量（320是按上述操作條件，當(dāng)吸光度值等于1.0時(shí)，相當(dāng)于320 μg）。

2　結(jié)果與分析

2.1檢測(cè)波長的選擇

類黃酮與鋁離子在堿性溶液中會(huì)生成紅色絡(luò)合物，在370 nm～600 nm之間有吸收光譜。將一定濃度的食用玫瑰類黃酮提取反應(yīng)液和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)液在370 nm～600 nm波長之間進(jìn)行掃描，得到圖1。

圖1　反應(yīng)液掃描光譜圖Fig.1　The photo spectrum of the sample and standard

從圖1中可知，食用玫瑰類黃酮與對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁有相似的理化、光學(xué)性質(zhì)，反應(yīng)液的吸收光譜圖整體趨勢(shì)基本一致，最大吸收峰均在420 nm波長處。

2.2測(cè)定方法中試劑濃度的選擇

為考察試劑濃度對(duì)測(cè)定方法的影響，分別選取不同濃度的亞硝酸鈉溶液（2%、4%、6%、8%、10%）、硝酸鋁溶液（2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%）、氫氧化鈉溶液（1%、3%、5%、7%、9%）進(jìn)行篩選，結(jié)果見圖2。

圖2 試劑濃度的選擇Fig.2　The result of diferent concentration of the solution

從圖2中可知，當(dāng)亞硝酸鈉溶液濃度在5%～8%范圍內(nèi)時(shí)，類黃酮與Al3+生成紅色絡(luò)合物的吸光度值相對(duì)穩(wěn)定；隨硝酸鋁濃度的增加，類黃酮與Al3+生成紅色絡(luò)合物的吸光度呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，當(dāng)硝酸鋁濃度在5%～10%時(shí)，吸光度值相對(duì)穩(wěn)定；氫氧化鈉溶液濃度對(duì)類黃酮與Al3+生成紅色絡(luò)合物的吸光度值影響較小，當(dāng)氫氧化鈉溶液濃度大于4%時(shí)，吸光度值變化幅度很小。故本試驗(yàn)選擇亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉三種溶劑的濃度分別選擇為5%、5%、4%。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按照1.6進(jìn)行測(cè)試，檢測(cè)的結(jié)果見表1。

對(duì)表1進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線的線形回歸方程為：Y=0.051 7+0.000 7x，相關(guān)系數(shù)為r2=0.999 98，表明在50 mg/L～600 mg/L濃度范圍內(nèi)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度與吸光度有良好的線形關(guān)系。對(duì)添加低濃度水平的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的食用玫瑰花樣品進(jìn)行測(cè)定，以10倍信噪比計(jì)算方法的檢出限為2.0 mg/kg。

表1　標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)Table 1　The result of standard curve

2.4顯色時(shí)間穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

為探討類黃酮與Al3+生成紅色絡(luò)合物的穩(wěn)定性是否影響吸光度的測(cè)定，本研究取一定濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照優(yōu)化后的試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行測(cè)定，在25℃下檢測(cè)不同放置時(shí)間對(duì)紅色絡(luò)合物的吸光度穩(wěn)定性的影響見表2。

表2穩(wěn)定性試驗(yàn)Table 2　The stability experiment

從表2中可知，隨著紅色絡(luò)合物生成時(shí)間的延長，反應(yīng)液吸光值有增大趨勢(shì)，但增大幅度較小，2 h內(nèi)反應(yīng)液吸光值變化幅度僅小于2.5%，這表明生成的紅色絡(luò)合物在2 h內(nèi)是穩(wěn)定的。為提高測(cè)定類黃酮的準(zhǔn)確性，本試驗(yàn)選擇30 min內(nèi)進(jìn)行比色檢測(cè)定量。

2.5回收率和精密度

在3個(gè)不同測(cè)試樣品溶液中加入一定量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，按試驗(yàn)方法測(cè)定其加標(biāo)回收率，測(cè)試結(jié)果見表3。

表3 回收率、精密度的測(cè)定（n=6）Table 3　Determination of recovery and precision（n=6）

從表3中可知，此方法的加標(biāo)回收率在95.43%～104.67%之間，變異系數(shù)在0.86%～2.57%之間，表明該方法準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好、精密度好。

3　結(jié)論

由于近年來國內(nèi)外學(xué)者對(duì)食用玫瑰花的研究主要是色素方面，對(duì)類黃酮等化學(xué)成分方面的研究較少。食用玫瑰花中含有蘆丁、槲皮甙、異槲皮甙等類黃酮，而類黃酮與鋁離子在堿性溶液中容易生成紅色絡(luò)合物，在適當(dāng)?shù)臐舛葏^(qū)間里，其濃度與吸光度之間的關(guān)系符合朗伯-比爾定律。為此，本研究以蘆丁為對(duì)照品，建立了紫外分光光度法測(cè)定食用玫瑰花中類黃酮的方法，在420 nm波長處有最大吸收峰，在50 mg/L～600 mg/L濃度范圍之間，吸光度與樣品濃度之間呈現(xiàn)良好的線形關(guān)系，檢出限為2.0 mg/kg；回收率在95.43%～104.67%之間，變異系數(shù)在0.86%～2.57%。試驗(yàn)結(jié)果說明本方法儀器設(shè)備要求低、操作簡(jiǎn)便快速、穩(wěn)定性高、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好。

參考文獻(xiàn)：

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.038

收稿日期：2014-04-20

作者簡(jiǎn)介：李絢（1979—），女（漢），工程師，本科，研究方向：食品藥品檢驗(yàn)。

Determining the Content of Flavonoids in the Edible Roses by UV Spectrophotometry

LI Xuan，LONG Min-yi
（Zhaoqing Institute for Food and Drug Control，Zhaoqing 526020，Guangdong，China）

Abstract：A method for determination of the concentration of edible rose flaqvonoids was developed by UV spectrophotometry.420 nm was the optimal determinate wavelength.The regression equation was Y=0.051 7+ 0.000 7x.Between the absorbance and the concentration of flavonoids，there was a favorable linear relationship with r2=0.999 98 in the range from 50 mg/L to 600 mg/L，with values of detection limit of 2.0 mg/kg.The average recovery rates were from 95.43%to 104.67%，RSD were from 0.86%to 2.57%.

Key words：edible rose；flavonoids；UV spectrophotometry