GPC凈化-GC-MS法測(cè)定烤鰻中硫丹及其代謝物殘留

劉海燕，呂蓉，凌晶，劉針鈴，左海根，郭平（江西出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫綜合技術(shù)中心，江西南昌330000）

GPC凈化-GC-MS法測(cè)定烤鰻中硫丹及其代謝物殘留

劉海燕，呂蓉，凌晶，劉針鈴，左海根，郭平
（江西出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫綜合技術(shù)中心，江西南昌330000）

摘要：建立了烤鰻中α-硫丹、β-硫丹及硫丹硫酸酯殘留的GPC凈化-GC/MS檢測(cè)方法。樣品經(jīng)丙酮等溶劑提取，凝膠滲透色譜（GPC）凈化，GC-MS（NCI）檢測(cè)和確證。α-硫丹、β-硫丹及硫丹硫酸酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度在0.5 g/L～20 g/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，在烤鰻中不同質(zhì)量濃度水平的加標(biāo)平均回收率為76.9%～86.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD=6）為4.6%～7.6%，檢出限（S/N=3）為0.01 μg/kg～0.03 μg/kg。

關(guān)鍵詞：凝膠滲透色譜（GPC）；氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）；硫丹；硫丹硫酸酯；烤鰻

硫丹（endosulfan）是一種高毒有機(jī)氯殺蟲劑，常被廣泛應(yīng)用于很多農(nóng)作物上，但它的危害性極高，對(duì)生殖系統(tǒng)等有損傷和誘變作用[1]。由于農(nóng)業(yè)上的不合理使用及雨水淋溶，硫丹進(jìn)入環(huán)境后具有較高的持久性，其在植物和土壤中氧化并主要形成的硫丹硫酸酯代謝物與母體化合物毒性相當(dāng)，在環(huán)境中的半衰期更長(zhǎng)，對(duì)環(huán)境構(gòu)成巨大威脅[2]。由于硫丹具有持久性污染、高毒性、生物富集性等特點(diǎn)，已經(jīng)成為一個(gè)極具爭(zhēng)議的農(nóng)藥，目前在50多個(gè)國(guó)家被禁止使用，包括美國(guó)、新西蘭、澳大利亞、歐盟、一些亞洲和西非國(guó)家。2010年10月，硫丹被納入斯德哥爾摩公約持久有機(jī)污染物附件A中，禁止在全球使用和制造。我國(guó)烤鰻出口對(duì)象國(guó)主要集中在日本、韓國(guó)，硫丹是日本高度關(guān)注的監(jiān)控項(xiàng)目之一，已被實(shí)行命令檢查。日本在2006年5月實(shí)施的《食品殘留農(nóng)業(yè)化學(xué)品肯定列表制度》（簡(jiǎn)稱“肯定列表制度”）中規(guī)定水產(chǎn)品中硫丹最大殘留量為0.004 mg/kg。為了保障出口產(chǎn)品的質(zhì)量，國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫局總局也將水產(chǎn)品的硫丹列為重點(diǎn)監(jiān)控項(xiàng)目之一。

目前，硫丹殘留量測(cè)定方法有氣相色譜法-電子捕獲法[3-5]、氣相色譜-質(zhì)譜法[6-7]。大多數(shù)采用弗羅里硅土等固相萃取柱凈化?？决牷|(zhì)較為復(fù)雜，富含大量的蛋白質(zhì)、脂類化合物等，而且殘留物濃度很低，樣品的凈化至關(guān)重要，樣品處理不當(dāng)，會(huì)對(duì)農(nóng)殘分析產(chǎn)生嚴(yán)重干擾。凝膠滲透色譜（GPC）是在農(nóng)藥殘留分析中使用較多的前處理凈化方法，尤其對(duì)動(dòng)物脂肪、牛奶、食用油等富含油脂、蛋白質(zhì)、色素的樣品凈化效果好[8]，GPC能有效去除烤鰻樣品中的的蛋白質(zhì)及脂類等大分子干擾物。GPC凈化-GC/MS法測(cè)定烤鰻中的硫丹及其代謝物殘留檢測(cè)方法國(guó)內(nèi)鮮見報(bào)道。該方法靈敏、準(zhǔn)確、高效，最低檢出限（S/N=3）達(dá)到0.01 μg/kg～0.03 μg/kg，可滿足烤鰻中硫丹及代謝物殘留的檢測(cè)要求。

1　材料與方法

1.1儀器與設(shè)備

Agilent 6890氣相色譜儀、Agilent 5975B質(zhì)譜儀-配備NCI負(fù)化學(xué)離子源：Agilent公司；Ultra全自動(dòng)預(yù)濃縮-GPC凈化-定量濃縮系統(tǒng)：德國(guó)LC Tech公司；IKA ULTRA-TURRAX T25均質(zhì)器：德國(guó)IKA公司；R-215旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)裝置：瑞士BUCHI公司；N-EVAP-24氮吹濃縮儀：美國(guó)Organomation公司；SHZ-C水浴恒溫振蕩器：金壇市鑫鑫實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；ELGA PURE LAB ULTRA MK2超純水一體機(jī)：法國(guó)威立雅公司；VORTEX GENIE2漩渦混合器：SCIENTIFIC INDUSTRIES公司；BSA2202S電子天平：德國(guó)Sartorius公司。

1.2材料與試劑

烤鰻來(lái)自于國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫局總局殘留監(jiān)控計(jì)劃抽樣。

丙酮、石油醚（沸程30℃～60℃）、正己烷、環(huán)己烷、乙酸乙酯（均為色譜純）：德國(guó)CNW公司；氯化鈉：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；3種標(biāo)準(zhǔn)品：α-硫丹（alpha-Endosulfan）、β-硫丹（beta-Endosulfan）及硫丹硫酸酯（Endosulfan sulfate）（純度≥99.0%）：德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取3種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品0.010 0g，用少量丙酮溶解后，用正己烷定容至100 mL容量瓶中，配制成100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。取一定體積的每種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用正己烷稀釋成1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，4℃冰箱保存，可使用1個(gè)月。檢測(cè)前加入正己烷梯度配制成質(zhì)量濃度分別為20、10、5、2、1、0.5 μg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)系列。

1.3.2樣品前處理

取烤鰻可食部分，用組織搗碎機(jī)充分搗碎均勻。稱取20.00 g試樣（精確至0.01 g）于250 mL具塞三角瓶中，加超純水6 mL，準(zhǔn)確加入丙酮40 mL，以轉(zhuǎn)速15 000 r/min均質(zhì)1 min，加入6 g氯化鈉，充分搖勻，再加30 mL石油醚，振蕩30 min。準(zhǔn)確吸取35 mL有機(jī)層上清液于平底燒瓶中，旋蒸濃縮至約1 mL，加5 mL乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1，體積比）于平底燒瓶中再濃縮，重復(fù)兩次，濃縮液轉(zhuǎn)移至加25 mL容量瓶中，用乙酸乙酯-環(huán)己烷（1∶1，體積比）定容至刻度，搖勻。通過(guò)0.22 μm的有機(jī)系濾膜后，轉(zhuǎn)移至凝全自動(dòng)預(yù)濃縮-GPC凈化-定量濃縮系統(tǒng)上凈化，采用GC-MS（NCI）法檢測(cè)和確證。

1.3.3色譜條件

凝膠滲透色譜（GPC）條件：凝膠色譜柱（320 mm× 25 mm）；Bio-Beads S-X3作為柱填料；流動(dòng)相為環(huán)己烷-乙酸乙酯（1∶1，體積比）；流速：5 mL/min；進(jìn)樣體積：5.0 mL；收集時(shí)間段：1 080 s～1 800 s；濃縮溫度：40℃；定容體積：2 mL。

氣相色譜（GC）條件：Agilent DB-1701石英毛細(xì)管氣相色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升溫條件：50℃保持2 min，以30℃/min速率升至130℃，以10℃/min速率升至260℃，保持5 min，總運(yùn)行時(shí)間22.67 min；進(jìn)樣口溫度：250℃；載氣：高純氦氣（純度≥99.999%）；流速：1.3 mL/min；不分流進(jìn)樣，0.75 min后開閥；進(jìn)樣量：1.0 μL；溶劑延遲5 min。

質(zhì)譜（MS）條件：負(fù)化學(xué)離子源（NCI）；離子源溫度：230℃；傳輸線溫度：280℃；反應(yīng)氣：甲烷氣；選擇離子監(jiān)測(cè)方式 SIM；α-硫丹、β-硫丹監(jiān)測(cè)離子 m/z為404，406，408，410，定量離子m/z為406；硫丹硫酸酯監(jiān)測(cè)離子m/z為384、386、388、390，定量離子m/z為386。

2　結(jié)果與分析

2.1凈化條件的確定

2.1.1凈化方式的選擇

除去油脂是非常關(guān)鍵的步驟，通常采用超低溫冷凍除脂[9-10]、固相萃?。⊿PE）柱[11-14]和凝膠滲透色譜（GPC）凈化[15-17]。本試驗(yàn)考察了-18℃冷凍除脂聯(lián)合C18固相萃取柱（C18SPE，1 g/6 mL）、石墨化碳黑固相萃取柱（GCB SPE，500 mg/3 mL）串聯(lián)中性氧化鋁固相萃取柱（Al2O3SPE，1.0 g/3 mL）、GPC凈化這3種凈化方式對(duì)烤鰻加標(biāo)樣品凈化的除油效果和回收率情況。結(jié)果：GPC凈化效果最好，洗脫液中基本沒(méi)有油脂，α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯回收率均達(dá)70%以上；-18℃冷凍除脂聯(lián)合C18SPE柱凈化回收率僅有35%，原因可能為在-18℃冷凍下去除大部分油脂時(shí)，一同去除了部分目標(biāo)化合物；GCB SPE柱串聯(lián)Al2O3SPE柱除油效果差，洗脫液中仍含有大量的油脂，檢測(cè)時(shí)對(duì)色譜柱損害大、響應(yīng)驟降。

2.1.2GPC凈化的條件優(yōu)化

本試驗(yàn)將添加100 μg/L的烤鰻樣品提取液，過(guò)GPC凈化，通過(guò)收集GPC不同時(shí)間段的流出液，觀察其含油量的變化及用GC-MS分析含量。試驗(yàn)結(jié)果表明，烤鰻提取液中的蛋白質(zhì)及脂類等大分子干擾物基本流出的時(shí)間為1 080 s，目標(biāo)物集中在1 080 s～1 800 s流出，目標(biāo)物流出曲線見圖1。

圖1　硫丹及硫丹硫酸酯在GPC條件下的回收率Fig.1　Recoveries of endosulfan and endosulfan sulfate by GPC

因此，本試驗(yàn)最終選用GPC凈化烤鰻提取液，收集1 080 s～1 800 s流出液。

2.2檢測(cè)方式的選擇

硫丹是全球禁止使用的藥物，日本在“肯定列表制度”中規(guī)定水產(chǎn)品中硫丹最大殘留量為0.004 mg/kg，檢測(cè)對(duì)儀器的靈敏度要求較高?？紤]到硫丹及其代謝物具有很強(qiáng)的電負(fù)性，GC-MS（NCI）對(duì)該物質(zhì)具有很高的靈敏度，且質(zhì)譜法為確證方法，對(duì)結(jié)果的判斷優(yōu)于氣相法。本試驗(yàn)采用烤鰻樣品進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，樣品經(jīng)處理后用GC-MS（NCI）測(cè)定，回收率均達(dá)到70%以上，標(biāo)準(zhǔn)、經(jīng)GPC凈化的加標(biāo)（10 μg/kg）烤鰻樣品及空白烤鰻樣品色譜圖如圖2所示。

圖2　標(biāo)準(zhǔn)、經(jīng)GPC凈化的加標(biāo)（5 μg/kg）烤鰻樣品及空白烤鰻樣品色譜圖Fig.2　Chromatogram of standard，spiked eel sample（5 μg/kg）with GPC purification and blank eel sample

從譜圖可看出基質(zhì)中不含有硫丹和硫丹硫酸酯，無(wú)干擾成分存在。因此本試驗(yàn)采用GC-MS（NCI）檢測(cè)和確證。

2.3線性范圍和檢出限

在最佳試驗(yàn)條件下，取一系列不同質(zhì)量濃度的α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，以儀器響應(yīng)峰面積對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯的質(zhì)量濃度在0.5 μg/L～2 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，各組分的線性范圍、線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表1。

表1　回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 1　Regression equations，linear ranges，correlation coefficients and detection limits

根據(jù)3倍信噪比測(cè)得3種分析物的檢出限為0.01 μg/kg～0.03 μg/kg。

2.4回收率和精密度

在不含農(nóng)藥的烤鰻樣品中分別添加低、中、高3個(gè)水平的3種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，平行測(cè)定6次，結(jié)果，3種分析物的平均回收率為76.9%～86.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.6%～7.6%，具體結(jié)果如表2所示。

表2　3種農(nóng)藥在烤鰻中的添加回收率和精密度（n=6）Table 2　Recoveries and precision of 3 pesticides in eel（n=6）

2.5實(shí)際樣品分析

應(yīng)用所建立的GPC凈化-GC-MS法檢測(cè)了2014年國(guó)家質(zhì)檢總局殘留監(jiān)控計(jì)劃中規(guī)定的烤鰻中硫丹及其代謝物的殘留，共檢測(cè)88批次烤鰻樣品進(jìn)行檢測(cè)，硫丹（以α-硫丹、β-硫丹及硫丹代謝物硫丹硫酸酯總量計(jì)）檢出率達(dá)17.9%，其中殘留量最高達(dá)0.025 mg/kg，主要檢出為硫丹硫酸酯殘留超標(biāo)，超過(guò)了日本“肯定列表制度”規(guī)定的鰻魚中硫丹最大殘留限量0.004 mg/kg的要求。

3　結(jié)論

本文建立了應(yīng)用GPC凈化-GC/MS法測(cè)定烤鰻中硫丹及其代謝物殘留的方法。樣品經(jīng)丙酮等提取，凝膠滲透色譜凈化，GC/MS檢測(cè)和確證，外標(biāo)法定量。通過(guò)大量烤鰻樣品試驗(yàn)驗(yàn)證，α-硫丹、β-硫丹及硫丹硫酸酯的線性關(guān)系良好，在烤鰻中不同質(zhì)量濃度水平的加標(biāo)平均回收率為76.9%～86.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD=6）為4.6%～7.6%，方法的檢出限（S/N=3）為0.01 μg/kg～0.03 μg/kg，該方法具有高效、定性準(zhǔn)確、靈敏度高等特點(diǎn)，可滿足烤鰻中硫丹及代謝物殘留的檢測(cè)限量要求。

硫丹殘留在水產(chǎn)品中的高檢出率，可能是由于水源受硫丹污染，硫丹在水中很快被污泥和水生生物吸附，繼而造成養(yǎng)殖環(huán)境污染和水產(chǎn)品中的殘留超標(biāo)。硫丹殘留問(wèn)題應(yīng)引起水產(chǎn)品養(yǎng)殖管理部門及相關(guān)企業(yè)的重視。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.031

收稿日期：2014-12-29

基金項(xiàng)目：江西省青年科學(xué)基金項(xiàng)目（20142BAB213028）

作者簡(jiǎn)介：劉海燕（1984—），女（漢），助理工程師，碩士，主要從事食品質(zhì)量安全檢測(cè)工作。

Determination of Endosulfan and Its Metabolites Residues in Roasted Eel by GC/MS with GPC Purification

LIU Hai-yan，Lü Rong，LING Jing，LIU Zhen-ling，ZUO Hai-gen，GUO Ping
（Technical Center of Jiangxi Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Nanchang 330000，Jiangxi，China）

Abstract：An analytical method for the determination of alpha-Endosulfan，beta-Endosulfan and Endosulfan sulfate residues in Roasted Eel by GPC-GC/MS.Samples were extracted with acetone and other solvents，purified by GPC，then determined by GC-MS（NCI）.Good linear relationships were obtained between the peak areas and the concentrations of alpha endosulfan，beta-endosulfan and endosulfan sulfate within the range of 0.5 g/L-20 g/L.The recovery of standard addition of pesticides in different concentration levels in roasted eel rate respectively were 76.9%-86.6%，relative standard deviation（RSD=6）was 4.6%-7.6%.Method detection limit（S/N=3）was 0.01 μg/kg-0.03 μg/kg.

Key words：gel permeation chromatography（GPC）；gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）；endosulfan；endosulfan sulfate；roasted eel