O-季銨化-N-(4-十二烷氧基)殼聚糖苯甲醛席夫堿 的制備及膠束pH 響應(yīng)性

林意華，李明春，辛梅華，陳燕燕

（華僑大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，環(huán)境友好功能材料教育部工程中心，福建 廈門 361021）

殼聚糖是無(wú)毒、生物相容性良好的天然多糖，近年來(lái)對(duì)殼聚糖進(jìn)行各種親/疏水改性制備智能化殼聚糖衍生物，用于藥物增溶、藥物控制釋放等領(lǐng)域的研究不斷深入[1]。

具有pH 響應(yīng)的藥物載體是根據(jù)人體病變部位細(xì)胞與正常細(xì)胞周圍pH 值環(huán)境不同而設(shè)計(jì)的。亞胺（Schiff 堿）由于具有動(dòng)態(tài)共價(jià)鍵的性質(zhì)，可作為pH 響應(yīng)位點(diǎn)應(yīng)用于pH 敏感藥物傳輸領(lǐng)域[2]。苯甲基亞胺由于苯環(huán)與C=N 共軛作用在生理pH 值環(huán)境下穩(wěn)定性良好，而在弱酸環(huán)境下（如腫瘤細(xì)胞外環(huán)境）水解[3]，并且苯甲基亞胺的合成反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)效率高[4]，利用苯甲基亞胺的pH 敏感性構(gòu)筑新型的pH 敏感藥物載體引起了人們的關(guān)注。Ding 等[5]合成了兩端帶有苯甲醛基的溫敏PEO-PPO-PEO 共聚物，將其與乙二醇基殼聚糖反應(yīng)，制備了pH 值、溫度雙敏感可注射凝膠，并應(yīng)用于包覆親水藥物和疏水藥物。藥物的釋放速度可以通過(guò)改變pH 值和環(huán)境溫度調(diào)節(jié)。Wang 等[6]以聚乙二醇-聚賴氨酸嵌段共聚物為主鏈接枝4-癸烷氧基苯甲醛，形成的雙親性的梳型聚合物分子鏈組裝成聚合物膠束。該膠束在生理?xiàng)l件（pH 值為7.4）穩(wěn)定，在一般腫瘤組織pH 值環(huán)境（pH 值為6.5）時(shí)由于苯甲基亞胺鍵斷裂而解組裝，從而實(shí)現(xiàn)了包載尼羅紅的pH 值響應(yīng)釋放。Jiang 等[7]利用N-異丙基丙烯酰胺與香草醛改性殼聚糖，合成了具有pH值、溫度雙敏感性的殼聚糖衍生物，同樣實(shí)現(xiàn)了藥物的控制釋放。本文制備了新型的殼聚糖衍生物O-季銨化-N-(4-十二烷氧基)殼聚糖苯甲醛席夫堿（QA-CS-DBA），見(jiàn)圖1；考察了 QA-CS-DBA 膠束的形成以及在不同pH 值環(huán)境下的行為，為殼聚糖在難溶藥物增溶以及藥物緩釋載體方面的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

Bruker Avance III 型（500MHz）核磁共振波譜儀（Bruker）；Nexusu 470 型傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet）；FD-1B-50 型冷凍干燥機(jī)（博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器公司）； Vario Micro 元素分析儀（Elementar）； FLS920 型全功能穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀（Edinburgh Instruments）；ZEN3600 納米激光粒度及 Zeta 電位分析儀（Malvern）。

1.2 O-季銨化-N-(4-十二烷氧基)殼聚糖苯甲醛席夫堿的制備

1.2.1 4-十二烷氧基苯甲醛的合成及表征

按照文獻(xiàn)[8]的方法合成4-十二烷氧基苯甲醛（DBA）。用1H NMR 對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行表征。

1.2.2 N-(4-十二烷氧基)殼聚糖苯甲醛席夫堿的 合成

1g 殼聚糖分散于60mL 甲醇-水（體積比為1/1）中，升溫至50℃。將上面制備的4-十二烷氧基苯甲醛4.30g 溶于10mL 甲醇后滴加于CS 甲醇-水中，50℃恒溫反應(yīng)24h，抽濾，乙醇索氏提取48h 以上，真空干燥得到CS-DBA 粉末。用FTIR 及元素分析進(jìn)行表征。

1.2.3 O-季銨化-N-(4-十二烷氧基)殼聚糖苯甲醛席夫堿的合成

[9]的方法制備O-季銨化-N-(4-十二烷氧基)殼聚糖苯甲醛席夫堿（QA-CS-DBA）。操作如下： 1g CS-DBA 分散于70mL 異丙醇中，升溫至70℃；將5.7g 2,3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨溶于6mL 水中滴加于上述溶液，70℃反應(yīng)24h；抽濾，乙醇索提48h 以上，真空干燥得QA-CS-DBA 粉末；用FTIR 及元素分析表征。

1.3 臨界膠束濃度測(cè)定

以芘為熒光探針，采用穩(wěn)態(tài)熒光法測(cè)定O-季銨化-N-(4-十二烷氧基)殼聚糖苯甲醛席夫堿（QA-CS-DBA）的臨界膠束濃度（CMC）值[10]，激發(fā)波長(zhǎng)339nm，掃描范圍350～450nm，狹縫寬度0.7nm。

圖1 DBA 與QA-CS-DBA 的合成路線

1.4 載藥膠束制備

稱取75mg QA-CS-DBA粉末溶于25mL 去離子水中，將75mg 酮洛芬溶于2.5mL 無(wú)水乙醇中，邊攪拌邊滴加到上述溶液中，滴加完畢超聲30min，二次水透析12h 以上。透析袋中的載藥膠束溶液離心后用0.45μm 濾膜過(guò)濾，得到載藥膠束溶液，真空冷凍干燥得載藥膠束凍干粉。同樣操作制備QA-CS-DBA 空白膠束凍干粉。

1.5 載藥量及包封率測(cè)試

取1mL 上述1.3 節(jié)制備的載藥膠束溶液于25mL 容量瓶中，乙醇定容，振蕩30min 后過(guò)濾，測(cè)定濾液在260nm 處的紫外吸光值A(chǔ)，根據(jù)酮洛芬乙醇溶液的線性方程 A=72.902C+0.0205（R2= 0.9994），C 為酮洛芬濃度，線性范圍 0 ～0.025mg/mL，求得膠束內(nèi)酮洛芬的質(zhì)量。依照式（1）和式（2）計(jì)算QA-CS-DBA 載酮洛芬膠束的包封率和載藥量。

式中，m1為膠束內(nèi)酮洛芬的質(zhì)量，mg；m2為加入的酮洛芬總質(zhì)量，mg；m 為載體的質(zhì)量，mg。

1.6 載藥膠束在不同pH 值的藥物釋放行為

測(cè)定膠束在生理?xiàng)l件（pH 值為7.40）以及一般腫瘤組織pH 值環(huán)境（pH 值為6.50）中的藥物釋放行為。稱取20mg 載藥膠束（載藥量為39.37%）于透析袋中，分別置于含25mL pH 值為7.40 和pH值為6.50 的磷酸鹽（PBS）緩沖溶液的錐形瓶，37℃恒溫振蕩，間隔一定時(shí)間取4mL 透析液，同時(shí)補(bǔ)充4mL 相同pH 值的PBS 緩沖液。透析液在260nm測(cè)定吸光值A(chǔ)，根據(jù)酮洛芬在pH 值為7.40 和pH值為 6.50 的 PBS 緩沖溶液中的線性方程 A= 61.184C+0.0101（R2= 0.9995）和A=61.574C+ 0.0129（R2=0.9990），式中C 為酮洛芬濃度，mg/mL，線性范圍0～0.025mg/mL，計(jì)算酮洛芬的含量，繪制載藥膠束在不同pH 值介質(zhì)的釋藥量與時(shí)間關(guān)系 曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)物的紅外分析

圖2 原料和產(chǎn)物的FT-IR 圖

采用KBr 壓片法測(cè)得殼聚糖（CS）、N-(4-十二烷氧基)殼聚糖苯甲醛（CS-DBA）和 O-季銨化- N-(4- 十二烷氧基) 殼聚糖苯甲醛席夫堿（QA-CS-DBA）的紅外光譜圖如圖2 所示。圖2中a、b、c 分別為CS、CS-DBA 和QA-CS-DBA 的紅外吸收譜線。與a 相比，b 在1640cm-1出現(xiàn)的新峰為C=N 吸收峰[11]； 1467cm-1為烷基鏈中亞甲基上的C—H 彎曲峰，721cm-1為n≥4 的(CH2)n基團(tuán)的骨架振動(dòng)峰[12]，1467cm-1為苯環(huán)伸縮振動(dòng)的特征峰。由紅外譜圖說(shuō)明，DBA 已經(jīng)接到殼聚糖的氨基上。c 與b 相比，c 在966cm-1的新峰為季銨鹽吸收峰，1479cm-1為季銨鹽基團(tuán)中甲基的C—H 不對(duì)稱伸縮峰[10]，說(shuō)明季銨鹽基團(tuán)已引入，由FTIR 圖說(shuō)明產(chǎn)物為QA-CS-DBA。

2.2 產(chǎn)物的1H NMR 分析

4-十二烷氧基苯甲醛（DBA）和O-季銨化- N-(4-十二烷氧基)殼聚糖苯甲醛席夫堿（QA-CS- DBA）分別溶于CD3Cl 和D2O 中，測(cè)定1H NMR如圖3 所示。圖3(a)為DBA 的1H NMR 圖，其中δ9.87 為DBA 上羰基H 質(zhì)子峰，δ7.82 與δ6.98 為苯環(huán)H 質(zhì)子峰。δ3.94 為DBA 與O 相連亞甲基H 質(zhì)子峰，δ1.82、δ1.29、δ1.33 為十二烷基鏈亞甲基H質(zhì)子峰，δ0.90 為DBA 中長(zhǎng)鏈烷基末端—CH3中H質(zhì)子峰[13]，由1H NMR 說(shuō)明產(chǎn)物為DBA。圖3(b)中δ4.50～3. 70 為殼聚糖骨架質(zhì)子峰，δ3.33 為季銨鹽氮上的3 個(gè)甲基質(zhì)子峰[10]，δ8.31 為—N=CH—中H的質(zhì)子峰[14]，δ7.52和δ6.66為苯環(huán)H質(zhì)子峰，δ3.94為側(cè)鏈DBA 與O 相連亞甲基H 質(zhì)子峰，δ1.22、δ1.02、δ0.80 為側(cè)鏈DBA 中長(zhǎng)鏈烷基H 質(zhì)子峰[13]，由1H NMR 進(jìn)一步說(shuō)明產(chǎn)物為QA-CS-DBA。

2.3 QA-CS-DBA 的元素分析

采用元素分析法，由C/N 摩爾比計(jì)算產(chǎn)物的取代度[15]，結(jié)果見(jiàn)表1。根據(jù)C/N 比計(jì)算原料殼聚糖的脫乙酰度為96.7%，4-(十二烷氧基)苯甲醛的取代度為43.1%，季銨化取代度為1.36%。季銨化度高可以提高產(chǎn)物的親水能力使產(chǎn)物溶于水。

圖3 產(chǎn)物的1H NMR 圖

表1 產(chǎn)物的元素分析結(jié)果及取代度

2.4 膠束性能參數(shù)表征

2.4.1 臨界膠束濃度

按照實(shí)驗(yàn)部分1.3 節(jié)的操作測(cè)得不同濃度QA-CS-DBA-芘的穩(wěn)態(tài)熒光光譜如圖4 所示。選取波長(zhǎng)372nm 和383nm 處的熒光強(qiáng)度值I372和I383，計(jì)算其比值I372/I383，進(jìn)一步計(jì)算并繪制lgC～I(xiàn)372/I383關(guān)系曲線如圖5 所示。分段做曲線的切線，切線的交點(diǎn)對(duì)應(yīng)的濃度即為QA-CS-DBA 的CMC值0.081mg/mL，該值遠(yuǎn)小于文獻(xiàn)報(bào)道的殼聚糖基 藥物載體材料的CMC 為0.714mg/m 和11～50μg/L[10，16]。臨界膠束濃度小說(shuō)明膠束具有很好的熱力學(xué)穩(wěn)定性，即使被稀釋到很低的濃度也能維持其膠束結(jié)構(gòu)[1]。這是因?yàn)槭杷榛溳^長(zhǎng)且柔順性 好，有利于組裝形成膠束，說(shuō)明QA-CS-DBA 具有良好的雙親性結(jié)構(gòu)。

圖4 不同濃度 QA-CS-DBA 水溶液中芘的穩(wěn)態(tài)熒光光 譜圖

圖5 芘的熒光發(fā)射強(qiáng)度比（I372/I383）與 QA-CS-DBA 濃度關(guān)系曲線

2.4.2 膠束的載藥量、包封率、粒徑及Zeta 電位

按照1.5 節(jié)操作測(cè)得QA-CS-DBA 載酮洛芬膠束的載藥量為39.37%，包封率為46.04%。

分別稱取5mg 空白膠束及載酮洛芬膠束凍干粉復(fù)溶于5mL pH 值為7.4 的磷酸鹽緩沖溶液中，測(cè)定平均粒徑及Zeta 電位。測(cè)得空白膠束的平均粒徑為285.0nm，如圖6 所示，載藥膠束（載藥量39.37%）的平均粒徑為341.0nm，比空白膠束粒徑大，說(shuō)明有酮洛芬載入膠束?？瞻啄z束Zeta 電位為31.2mV，載藥膠束Zeta 電位為30.8mV，Zeta 大于30mV，說(shuō)明膠束具有較好的穩(wěn)定性[15]。

2.4.3 QA-CS-DBA 膠束的形貌觀察

將1.4 節(jié)制備的QA-CS-DBA 載藥膠束凍干粉60℃真空干燥，用掃描電鏡觀察其形貌。由圖7可以看出膠束粒徑分布較為均勻，粒徑比上述采用納米激光粒度分析儀測(cè)得的341nm 略小，這可能是載藥膠束在冷凍干燥過(guò)程中收縮并相互擠壓造成。

圖6 空白膠束與載藥膠束的粒徑分布

圖7 載藥膠束的SEM 圖

2.5 QA-CS-DBA 膠束的pH 響應(yīng)性

2.5.1 膠束在不同pH 值條件下的Zeta 電位變化

參考文獻(xiàn)[6]通過(guò)Zeta 電位變化表征膠束的pH響應(yīng)性。將1.3 節(jié)中制備的空白膠束凍干粉溶解，用HCl 及NaOH 溶液交替調(diào)節(jié)pH 值，使pH 值在一般腫瘤組織環(huán)境pH 值為6.50 與生理環(huán)境pH 值為7.40 來(lái)回變化，分別測(cè)定溶液對(duì)應(yīng)的Zeta 電位，結(jié)果如圖8 所示。由圖8 可見(jiàn)Zeta 電位在pH 值為7.40 比pH 值為6.50 高，這是因?yàn)閜H 值為7.40 時(shí)，亞胺鍵（C=N）較為穩(wěn)定，而pH 值為6.50 時(shí)，亞胺鍵斷裂形成—NH3+，正電荷排斥導(dǎo)致膠束趨于不穩(wěn)定，Zeta 電位變大[6]。由此可見(jiàn)，膠束在pH值為6.50～7.40 的較小范圍內(nèi)即有響應(yīng)性。來(lái)回調(diào)節(jié)溶液pH 值，Zeta 電位發(fā)生響應(yīng)變化，說(shuō)明C=N鍵的形成與解離導(dǎo)致雙親性結(jié)構(gòu)的形成與破壞，并最終導(dǎo)致了自組裝膠束結(jié)構(gòu)的組裝與解組裝，從分子水平解釋了亞胺鍵的存在是導(dǎo)致 pH 響應(yīng)的 原因。

圖8 空白膠束的Zeta 電位隨pH 值轉(zhuǎn)變的關(guān)系

2.5.2 載藥膠束在不同pH 值的藥物釋放行為

按照實(shí)驗(yàn)部分1.6 節(jié)的操作測(cè)定膠束在生理?xiàng)l件（pH 值為7.40）以及一般腫瘤組織pH 值環(huán)境（pH值為6.50）中的藥物釋放行為，結(jié)果見(jiàn)圖9。由圖9可見(jiàn)，QA-CS-DBA 載藥膠束在pH 值為7.40 釋放較為平緩，10h 后累積釋放量為49.30%。而在pH值為6.50 的藥物釋放較快，在5h 左右基本達(dá)到平衡，48h 的累積釋放量為74.99%，高于pH 值為7.40的累積釋放量。這是因?yàn)樵趐H 值為6.50 時(shí)亞胺鍵斷裂，DBA 解離使得膠束的通透性發(fā)生了改變，導(dǎo)致藥物釋放速率加快[14]，比文獻(xiàn)報(bào)道的通過(guò)席夫堿橋聯(lián)藥物的殼聚糖聚合物膠束在pH值為6.8的釋放量66.7%要高[1]，且高的釋藥量能夠更好地殺滅癌細(xì)胞。并且在pH 值為6.50 時(shí)，載藥膠束在3.5h 以內(nèi)具有較快的釋放速率，說(shuō)明該載藥膠束具有較快的響應(yīng)速率。加快藥物在腫瘤組織以及內(nèi)含體內(nèi)部弱酸環(huán)境中的釋放有利于提高腫瘤組織及癌細(xì)胞內(nèi)部的藥物濃度，更好的發(fā)揮藥物的作用。

3 結(jié) 論

通過(guò)制備O-季銨化-N-(4-十二烷氧基)殼聚糖苯甲醛席夫堿(QA-CS-DBA)，并將其應(yīng)用于載藥膠束的制備，考察了pH 響應(yīng)性能及藥物釋放性能。結(jié)果表明QA-CS-DBA 在溶液中能形成穩(wěn)定的球形結(jié)構(gòu)膠束，膠束具有較小的CMC。膠束Zeta 電位隨pH 值不同而變化，具有pH 響應(yīng)性。載藥膠束在pH 值為7.40 時(shí)具有藥物緩釋效果，而在pH 值為6.50，即癌細(xì)胞周圍pH 值時(shí)，具有快速釋放效果，有望用于難溶抗癌藥物的增溶及控釋作用。

圖9 載藥膠束在不同pH 值介質(zhì)中的釋藥量與時(shí)間關(guān)系

參 考 文 獻(xiàn)

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