O-磺化/O-季銨化-N,N-雙烷基殼聚糖混合單分子膜及 自組裝囊泡性質(zhì)

毛揚(yáng)帆，李明春，辛梅華

（華僑大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，環(huán)境友好功能材料教育部工程中心，福建 廈門 361021）

自組裝是指由分子之間的非共價(jià)相互作用驅(qū)動(dòng)以及分子形狀自發(fā)識(shí)別而形成超分子結(jié)構(gòu)[1]。自組裝的形成一般由一種作用力為主或幾種作用力共同作用，其中靜電作用較其他二級作用力更強(qiáng)[2]。殼聚糖及其衍生物常用于具有靜電作用的自組裝中，Wang 等[3]制備了N,N-二甲基-N-十八烷基-賴氨酸改性殼聚糖（OQLCS），分別接枝聚乙二醇單甲醚（mPEG）和葉酸（FA），制得mPEG-OQLCS 和FA-OQLCS，將三者與膽固醇混合利用水化法制得自組裝囊泡，囊泡對鈣黃綠素具有低滲透率，可應(yīng)用于親水性藥物的包載。Fan 等[4]制備了兩親性的O-羧甲基-N-烷基化殼聚糖，研究了產(chǎn)物與陽離子表面活性劑十六烷基三甲基溴混合體系的自組裝行為，結(jié)果表明，混合體系能自發(fā)形成囊泡，靜電作用和疏水作用是囊泡形成的主要驅(qū)動(dòng)力。Shu 等[5]制備了N-(2-羥基)丙基-3-三甲基殼聚糖季銨鹽與硫酸葡聚糖自組裝納米球，以牛血清蛋白為模型藥物，研究了蛋白質(zhì)藥物在口服給藥領(lǐng)域的應(yīng)用，結(jié)果表明，在酸性條件下其納米球具有緩釋效果。Valente等[6]以殼聚糖和硫酸葡聚糖為原料制備載牛血清蛋白的納米粒，并與間充質(zhì)干細(xì)胞共同封裝至海藻酸鈉納米粒中形成新型雙藥物遞送系統(tǒng)，結(jié)果表明，納米粒通過靜電自組裝，具有粗糙的表面，有利于細(xì)胞遷移和黏附，載藥納米粒50h 的累積釋放率為10%，900h 釋放平衡的累積釋放率為35%左右。Martins 等[7]制備N,N,N-三甲基殼聚糖，與海藻酸鈉復(fù)合制備聚電解質(zhì)復(fù)合物，研究其對姜黃素的釋放，結(jié)果表明，其在模擬胃液中30h 釋放平衡的累積釋放率為20%。綜上所述，靜電作用對殼聚糖及其衍生物自組裝行為及藥物釋放行為具有一定的影響，目前靜電作用的自組裝研究主要集中在囊泡、納米粒等方面。在天然高分子共組裝領(lǐng)域，聚陽離子以殼聚糖及季銨化殼聚糖研究較多，聚陰離子則以海藻酸鈉、硫酸葡聚糖研究較多，且研究多為水溶性產(chǎn)物，油溶性產(chǎn)物的共組裝研究鮮有報(bào)道?；腔瘹ぞ厶亲鳛樗苄躁庪x子殼聚糖衍生物，不僅具有海藻酸鈉、硫酸葡聚糖所具有的生物相容性和生物可降解性，還具有抗病毒性、抗凝血性、抗菌性和成骨活性等優(yōu)點(diǎn)。本文制備了油溶性的O-磺化-N,N-雙十二烷基化殼聚糖（HSDLCS）和O-季銨化-N,N-雙十二烷基化殼聚糖（QADLCS），合成路線見圖1?？紤]雙親分子單分子膜的性質(zhì)在一定條件下可預(yù)測自組裝囊泡的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)[8]，本文研究了HSDLCS/QADLCS 混合單分子膜和自組裝囊泡的性能，為進(jìn)一步研究其自組裝行為提供依據(jù)。

圖1 殼聚糖衍生物HSDLCS 和QADLCS 的合成路線圖

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑及儀器

O-磺化-N,N-雙十二烷基化殼聚糖（HSDLCS）和O-季銨化-N,N-雙十二烷基化殼聚糖（QADLCS），實(shí)驗(yàn)室自制（殼聚糖的相對分子質(zhì)量為500000；HSDLCS 磺化度為21.67%，烷基化度為177.10%；QADLCS 季銨化度23.69%，烷基化度為178.59%。兩個(gè)產(chǎn)物均溶于THF、DMF 和氯仿）[9]；維生素B12，上海國藥集團(tuán)；其他試劑，均為市售分析純。

JML04S 型雙驅(qū)動(dòng)膜天平，上海中晨數(shù)字技術(shù)設(shè)備有限公司；UV-3 系列紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；HITACHI S-3500N 掃描電鏡，日本Hitachi 公司；ZEN3600 納米激光粒度及Zeta 電位分析儀，英國malvern 公司。

1.2 HSDLCS/QADLCS 混合單分子膜的π-A 等溫線測定

將殼聚糖主鏈相對分子質(zhì)量為500000 制得的HSDLCS 和QADLCS 分別溶解于氯仿中，于25mL容量瓶中配制成10-3mol/L 的溶液，按帶電基團(tuán)摩爾比1∶1 混合于10mL 容量瓶中。以二次水為亞相進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用微量進(jìn)樣器取40μL 樣品溶液，緩慢、均勻地滴加在亞相表面上，待溶液在亞相表面上鋪展并揮發(fā)約30min 后進(jìn)行壓縮，用Wilhelmy 吊片法測定π-A 等溫線。壓膜速率為20mm/min，室溫(20±1)℃， 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。配制相同濃度HSDLCS 和QADLCS 溶液，同樣方法測定單組分π-A 等溫線。

1.3 HSDLCS/QADLCS 復(fù)合囊泡的制備

0.1g 摩爾比為1∶1 的HSDLCS 和QADLCS 溶解于24mL 氯仿中，加入8mL 濃度為4mg/mL 的維生素B12溶液，冰浴超聲30min 形成W/O 乳液，低溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至膠狀半固體，放置過夜除氯仿。在冰浴下強(qiáng)力超聲10min，冷凍離心40min，分離載藥囊泡和未包封的藥物。同樣方法制備QADLCS、HSDLCS 載藥囊泡及空白囊泡。

1.4 囊泡的粒徑和Zeta 電位測定

將 1.3 節(jié)制得的 QADLCS、HSDLCS 及HSDLCS/QADLCS 自組裝囊泡制成囊泡-水懸混液，采用納米激光粒度及Zeta 電位分析儀在25℃下測定空白囊泡的粒徑分布及Zeta 電位。

1.5 自組裝囊泡的載藥性能和藥物釋放行為

將載藥囊泡放入透析袋并置于25mL 純水中，間隔1h 取出3mL 透析液，再補(bǔ)充3mL 蒸餾水。透析液在UV361nm 測定吸光值，根據(jù)B12標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算藥物釋放量（ C=0.05829A-0.00036 ，r=0.9995，線性范圍5.36×10-3～5.36×10-2mg/mL），繪制載藥囊泡釋放曲線。由公式包封率=(M1＋M2)/M×100%和載藥量=(M1＋M2)/M3（其中M1、M2、M3和M 分別為釋藥平衡時(shí)藥物總釋放量、未釋放藥物的質(zhì)量、囊材的質(zhì)量和總投藥量；M2是由乙醇破壞囊泡后離心得到的上清液，采用UV 測定吸光值并由B12標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得到），計(jì)算包封率和載藥量。

2 結(jié)果與討論

2.1 HSDLCS/QADLCS 混合單分子膜性質(zhì)

2.1.1 混合單分子膜的π-A 等溫線

按照實(shí)驗(yàn)部分1.2 的操作測得產(chǎn)物單分子膜的π-A 等溫線如圖2 所示，a、b、c 分別為O-磺化-N,N-雙十二烷基殼聚糖（HSDLCS）、O-季銨化-N,N-雙十二烷基殼聚糖（QADLCS）及HSDLCS/QADLCS混合單分子膜的π-A 曲線。由圖2 可見，HSDLCS、QADLCS 及混合單分子膜的π-A 等溫線都較為平滑，無明顯的液態(tài)擴(kuò)張相-液態(tài)凝聚相（LE-LC）轉(zhuǎn)變，崩潰壓均在35mN/m 以上，說明三者均可在水面上形成穩(wěn)定的單分子膜。從π-A 曲線得到相應(yīng)的崩潰壓和極限分子面積見表1。由圖2 和表1 可以看出，HSDLCS 的分子極限面積較QADLCS 低，這是因?yàn)榕c HSDLCS 的磺酸鹽基團(tuán)相比較，QADLCS 的季銨鹽基團(tuán)空間阻礙作用較大，且基團(tuán)間存在靜電作用及水化層[10]，從而影響了單分子膜分子間距離，導(dǎo)致QADLCS 的分子平均占有面積增大，所成的單分子膜較為擴(kuò)張。與單組分產(chǎn)物相比，HSDLCS/QADLCS 混合單分子膜的崩潰壓（46.14mN/m）和極限分子面積較大，這可能是因?yàn)槎咴谛纬蓡畏肿幽r(shí)，親水基團(tuán)進(jìn)入水相中，基團(tuán)之間易形成靜電相互作用，使膜壓縮至崩潰時(shí)需要的壓力更大，故崩潰壓更大。但季銨鹽陽離子周圍有3 個(gè)甲基的屏蔽，在一定程度上阻礙了陰陽離子表面活性劑極性頭基相互靠近，使得分子的平均占有面積更大，形成的單分子膜較為擴(kuò)張[11]。

圖2 HSDLCS、QADLCS 及其混合單分子膜的π-A 等溫線 （1?2=10-20m2）

表1 HSDLCS、QADLCS 及其復(fù)合單分子膜的崩潰壓、極限分子面積和最大壓縮模量

2.1.2 混合單分子膜的Cs-1-A 曲線

2.2 HSDLCS/QADLCS 復(fù)合囊泡的性質(zhì)

2.2.1 自組裝囊泡的SEM 圖

圖3 HSDLCS、QADLCS 及其混合單分子膜的Cs-1-A 曲線

按照實(shí)驗(yàn)部分1.3 節(jié)的方法制備HSDLCS/ QADLCS 復(fù)合囊泡。囊泡的SEM 圖如圖4 所示，可見，復(fù)合自組裝形成的囊泡接近于球形，粒徑在200～400nm。

圖4 HSDLCS/QADLCS 復(fù)合自組裝囊泡的SEM 圖

2.2.2 囊泡的粒徑大小、分布及Zeta 電位

按照實(shí)驗(yàn)部分1.4 節(jié)的操作測得囊泡的粒徑分布及Zeta 電位見表2。QADLCS、HSDLCS 和HSDLCS/QADLCS 自組裝囊泡的Zeta 電位分別為49.4mV、-42.4mV 和-6.94mV，單組分囊泡的Zeta電位絕對值均大于 30mV，說明 QADLCS 和HSDLCS 自組裝囊泡能夠穩(wěn)定存在。 而HSDLCS/QADLCS 復(fù)合囊泡的Zeta 電位較小，說明復(fù)合囊泡進(jìn)行自組裝時(shí)HSDLCS 的—SO3-基團(tuán)與QADLCS 的—N(CH3)3+基團(tuán)間存在靜電作用[12]，二者按比例復(fù)合后Zeta 電位不為0，則因?yàn)閮烧呔筛呦鄬Ψ肿淤|(zhì)量殼聚糖制備而成，長鏈分子本身容易形成纏結(jié)和嵌套等結(jié)構(gòu)，在空間位阻效應(yīng)、靜電作用及疏水作用的共同作用下，HSDLCS 分子鏈上的負(fù)電荷未能完全與QADLCS 分子鏈中的正電荷靜電結(jié)合，導(dǎo)致兩者形成囊泡時(shí)的電位不符合兩者完全復(fù)合的化學(xué)計(jì)量比[13]。

由表2 可以看出，QADLCS、HSDLCS 和HSDLCS/QADLCS 自組裝囊泡粒徑分別為345.6nm、344.3nm 和 359.9nm，比SEM 中粒徑略大。HSDLCS/QADLCS 復(fù)合囊泡的粒徑較單組分囊泡略大，這可能是因?yàn)榧句@鹽基團(tuán)為正四面體結(jié)構(gòu)，空間位阻較大，在一定程度上阻礙了陰陽離子表面活性劑極性頭基相互靠近[11]。3 種囊泡的多分散系數(shù)均在0.1～0.2，說明囊泡的粒徑比較均勻，具有單分散性。

表2 自組裝囊泡的粒徑大小、分布及Zeta 電位

2.2.3 囊泡的載藥性能及釋放行為

以維生素B12為模型藥物，按照實(shí)驗(yàn)部分1.3節(jié)的方法制備載藥囊泡，測得載藥量和包封率如表3 所示，與單組分囊泡相比，復(fù)合囊泡的載藥量和包封率較高。

表3 HSDLCS、QADLCS 及其復(fù)合囊泡的載藥量和包封率

載藥囊泡的釋放行為見圖5，a、b、c 分別為QADLCS、HSDLCS 載藥囊泡以及 HSDLCS/ QADLCS 復(fù)合載藥囊泡的釋放曲線。可見，3 種囊泡均有緩釋作用，在30h 左右達(dá)到釋藥平衡，其平衡釋放率分別為42.14%、38.16%和23.68%，藥物釋放速率和平衡釋放量順序?yàn)镼ADLCS＞HSDLCS＞HSDLCS/QADLCS 載藥囊泡，說明三者中復(fù)合囊泡的通透性最低，膜結(jié)構(gòu)較為緊密，這與單分子膜結(jié)果一致。與HSDLCS 結(jié)構(gòu)中的磺酸鹽基團(tuán)相比，季銨鹽基團(tuán)由于空間占有較大且基團(tuán)間存在一定的靜電排斥作用，使得QADLCS 囊泡結(jié)構(gòu)較為疏 松[14]。而HSDLCS/QADLCS 復(fù)合囊泡由于正、負(fù)離子極性頭基之間存在強(qiáng)烈的靜電作用，容易形成離子對結(jié)構(gòu)[4]，在靜電作用和疏水作用的共同驅(qū)動(dòng)下，復(fù)合囊泡具有更有序的結(jié)構(gòu)，藥物通透性降低。

圖5 自組裝囊泡的藥物釋放曲線

2.3 囊泡性質(zhì)與相應(yīng)單分子膜性質(zhì)的關(guān)系

囊泡的釋放行為取決于囊泡分子膜的藥物通透性，而單分子膜的最大壓縮模量可以在一定程度上反映囊泡膜結(jié)構(gòu)的緊密程度，通過對兩者關(guān)系的考察可以建立單分子膜與相應(yīng)自組裝囊泡性質(zhì)間的聯(lián)系[8，15]，為進(jìn)一步研究產(chǎn)物結(jié)構(gòu)、單分子膜、囊泡三者之間的關(guān)系提供理論依據(jù)。殼聚糖衍生物QADLCS、HSDLCS 及HSDLCS/QADLCS 單分子膜的最大壓縮模量與其相應(yīng)自組裝載藥囊泡藥物平衡釋放率關(guān)系如圖6 所示。從圖6 中可以看出，隨著產(chǎn)物單分子膜最大壓縮模量的增加，其相對應(yīng)自組裝載藥囊泡的藥物平衡釋放率降低，并呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系，說明殼聚糖衍生物結(jié)構(gòu)不同會(huì)導(dǎo)致單分子膜性質(zhì)及囊泡性質(zhì)的改變，通過產(chǎn)物單分子膜的最大壓縮模量能在一定程度上對囊泡結(jié)構(gòu)緊密程度進(jìn)行預(yù)測。

圖6 產(chǎn)物單分子膜性質(zhì)與相應(yīng)自組裝囊泡性質(zhì)之間的關(guān)系

3 結(jié) 論

制得 O- 磺化-N,N- 雙十二烷基殼聚糖（HSDLCS）和O-季銨化-N,N-雙十二烷基殼聚糖（QADLCS），研究HSDLCS/QADLCS 混合單分子膜和自組裝囊泡性質(zhì)的關(guān)系。結(jié)果表明，與單組分產(chǎn)物單分子膜性質(zhì)相比，HSDLCS/QADLCS 混合單分子膜具有較大的崩潰壓和壓縮模量；自組裝囊泡HSDLCS 和QADLCS 的Zeta 電位絕對值大于30mV，能夠穩(wěn)定存在，而HSDLCS/QADLCS 復(fù)合囊泡的Zeta 電位較低；HSDLCS/QADLCS 復(fù)合囊泡具有較高的載藥量和包封率，較低的藥物釋放率和平衡釋放量。3 種單分子膜的最大壓縮模量與其相應(yīng)載藥囊泡藥物平衡釋放率呈一定的線性關(guān)系。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究HSDLCS/QADLCS 混合自組裝行為提供依據(jù)。

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