海因改性N-季銨化殼聚糖衍生物的合成及其抗菌性能

陳燕燕，李明春，辛梅華，林意華

（華僑大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，環(huán)境友好功能材料教育部工程中心，福建 廈門 361021）

殼聚糖具有生物相容性、生物降解性、抗菌活性等優(yōu)良性能，被廣泛用于食品工業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)境保護(hù)等方面[1]。在殼聚糖的各種抗菌模型中，眾多學(xué)者都較傾向于氨基的作用機(jī)理，因此正電荷的引入或氨基量的增加成為殼聚糖抗菌改性的熱點(diǎn) 之一。

季銨化改性可以引入正電性基團(tuán)并且提高殼聚糖的水溶性，從而增強(qiáng)殼聚糖衍生物的抗菌效果。Qin 等[2]用小季銨鹽與殼聚糖反應(yīng)得到水溶性良好的殼聚糖季銨鹽，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有一定的抗菌活性，并且在堿性環(huán)境下的抗菌活性優(yōu)于弱酸環(huán)境。作者課題組[3]在合成的N,N,N-三甲基殼聚糖上引入小季銨鹽得到O-(2-羥丙基三甲基氯化銨)-N,N,N-三甲基殼聚糖，抗菌結(jié)果表明，引入小季銨鹽增強(qiáng)了N,N,N-三甲基殼聚糖的抗菌性，并且隨季銨化度的增加抗菌活性增強(qiáng)。

海因類殺菌劑母體都是5 位被二甲基取代的五元氮雜環(huán)化合物，常將其鹵化或羥甲基化后應(yīng)用于抗菌方面[4]。Li 等[5]用環(huán)氧海因（GH）改性殼聚糖制備chitosan-GH，其抗菌性能優(yōu)于殼聚糖。Yang等[6]通過對(duì)殼聚糖的C6-OH 改性制備6-氨基殼聚糖，抗菌結(jié)果表明，6-氨基殼聚糖與殼聚糖相比有較好的抗菌性能，是一種廣譜抗菌劑?？梢?，氨基含量增加或正電荷的引入提高了殼聚糖的抗菌活性。因此本工作首先制備季銨化殼聚糖，進(jìn)一步引入氮雜環(huán)-海因提高其抗菌性能，合成路線見圖1。試驗(yàn)了產(chǎn)物的抗菌活性，考察食品添加劑乙二胺四乙酸（EDTA）對(duì)產(chǎn)物抗菌活性的影響，為GH- HTCC 在食品及化妝品等行業(yè)的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器及試劑

TU-1810 紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器公司；FD-1B-50 冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器公司；VARIO EL Ⅲ元素分析儀，德國Elementa 公司；NEXUSU 470 型傅立葉變換紅外光譜儀，美國Nicolet 公司；AvanceⅡ型核磁共振分析儀，瑞士Bruker 公司。

1.2 產(chǎn)物的合成與表征

1.2.1 環(huán)氧丙基海因和N-(2-羥丙基三甲基氯化銨)殼聚糖的制備

（1）按照文獻(xiàn)[7]方法制備環(huán)氧海因：把3.2g的5,5-二甲基海因溶于15mL 水中，加入10mL 1%NaOH 溶液攪拌10min，滴加1.95mL 環(huán)氧氯丙烷（5,5-二甲基海因/環(huán)氧氯丙烷mol 比為1/1）于上述溶液中，室溫反應(yīng)10h。旋蒸去水，加入丙酮溶解產(chǎn)品，過濾除去沉淀的氯化鈉，旋蒸得環(huán)氧海因（GH）。

（2）參照文獻(xiàn)[2]的方法制備N-(2-羥丙基三甲基氯化銨)殼聚糖：將4.84g 殼聚糖溶于120mL 2%的乙酸溶液中，攪拌30min。27.29g 的2,3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨（與殼聚糖單元的摩爾比為6/1）溶于水滴加至上述溶液中，同時(shí)升溫至60℃，反應(yīng)24h。產(chǎn)品用蒸餾水透析（截留相對(duì)分子質(zhì)量為8000～12000），抽濾，旋蒸，凍干，得N-(2-羥丙基三甲基氯化銨)殼聚糖（HTCC）。

1.2.2 O-羥丙基(5，5-二甲基海因)-N-(2-羥丙基三甲基氯化銨)殼聚糖的制備

參考作者課題組[8]的方法制備O-羥丙基(5,5-二甲基海因)-N-(2-羥丙基三甲基氯化銨)殼聚糖：將2.88g 的HTCC 溶于30mL 水中，滴加等質(zhì)量的NaOH 溶液，60℃堿化1h。再將7.0g 環(huán)氧海因（與HTCC 單元摩爾比為3.5/1）溶于水滴至上述溶液中，60℃分別反應(yīng)6h、12h 和24h。產(chǎn)物用蒸餾水透析，旋蒸，凍干得O-羥丙基(5，5-二甲基海因)-N-(2-羥丙基三甲基氯化銨)殼聚糖（GH-HTCC）。

1.2.3 產(chǎn)物的表征

采用KBr 壓片，用P-E 傅里葉變換紅外光譜儀測(cè)定產(chǎn)物的紅外光譜。采用D2O 作溶劑，四甲基硅氧烷為內(nèi)標(biāo)，用Bruker-400 核磁共振譜儀測(cè)定產(chǎn)物的1H NMR。以甲醇作溶劑，DMH、GH、GH-HTCC 為溶質(zhì)，配制0.01mol/L 的溶液，用TU-1810 紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定產(chǎn)物在190～400 nm 的光譜吸收。通過Vario MICRO 元素分析儀進(jìn)行元素分析 測(cè)試。

圖1 O-羥丙基(5,5-二甲基海因)-N-(2-羥丙基三甲基氯化銨)殼聚糖的合成路線

1.3 產(chǎn)物的抗菌性能測(cè)試

1.3.1 培養(yǎng)基及樣品的配制

選用LB 培養(yǎng)基配方如下：1% NaCl、0.5%酵母提取物和1%胰蛋白胨（配制固體培養(yǎng)基時(shí)，需要再加入1.5%瓊脂粉），用1% NaOH 和1% HCl溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH 值。樣品的配制：配制2×104μg/mL 的樣品水溶液。培養(yǎng)基和樣品均在121℃高壓滅菌20min。

菌種的活化：將冰箱中保存的菌種連續(xù)培養(yǎng)兩次以上，使菌液濃度約為107～108CFU/mL，備用。

1.3.2 抑菌率的測(cè)定

參照作者課題組[3]的方法：配制pH 值7.2 含有樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%、菌液濃度約為107CFU/mL 的培養(yǎng)液，以不含樣品的培養(yǎng)液為對(duì)照組，在37℃搖床中培養(yǎng)（E. coli 1h，S. aureus 0.5h）。取25 μL 培養(yǎng)液稀釋，均勻涂覆在瓊脂板，在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)19～37h，觀察培養(yǎng)皿上的細(xì)菌生長(zhǎng)情況，根據(jù)稀釋倍數(shù)算出菌落數(shù)，并計(jì)算抑菌率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次取平均值。抑菌率計(jì)算如式（1）

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)物的FTIR 分析

采用KBr 壓片法測(cè)得產(chǎn)物的紅外譜圖如圖2 和圖3 所示。圖2 中a 是原料5,5-二甲基海因FTIR 譜線，b 是環(huán)氧海因FTIR 譜線。由圖2 可見，b 與a相比，在2926cm-1處出現(xiàn)環(huán)氧丙基的亞甲基的伸縮振動(dòng)峰，1076cm-1、1181cm-1是環(huán)氧結(jié)構(gòu)中C—O—C 的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)，912cm-1是環(huán)氧對(duì)稱伸縮振動(dòng)，是環(huán)氧的特征峰[9]，說明DMH 已被環(huán)氧氯丙烷成功改性得到目標(biāo)產(chǎn)物環(huán)氧丙基海因。

圖2 海因和環(huán)氧海因的FTIR 圖

圖3 CS、HTCC 和GH-HTCC 的FTIR 圖

圖3 中a、b、c 分別是殼聚糖、N-(2-羥丙基三甲基氯化銨)殼聚糖和O-羥丙基(5,5-二甲基海因)-N-(2-羥丙基三甲基氯化銨)殼聚糖的FTIR 譜線。b 與a 相比，1598cm-1處NH2的伸縮振動(dòng)峰消失，1568cm-1是N—H 變形振動(dòng)峰，而1481cm-1處出現(xiàn)小分子季銨鹽中CH3的C—H 不對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰[[2]，說明季銨鹽已接枝到殼聚糖的氨基上。c與b相比，1701cm-1和1763cm-1是海因結(jié)構(gòu)中酰胺鍵的伸縮振動(dòng)峰[10]，而2984～2875cm-1的峰形變寬，是因?yàn)閬喖谆囊耄f明環(huán)氧海因已成功接枝到季銨化殼聚糖上。

2.2 產(chǎn)物的1H NMR 分析

以D2O 為溶劑，測(cè)得產(chǎn)物N-(2-羥丙基三甲基氯化銨)殼聚糖和O-羥丙基(5,5-二甲基海因)-N-(2-羥丙基三甲基氯化銨)殼聚糖的1H NMR 如圖4 所示。在HTCC 的譜線中，δ 4.69 是氘代試劑的溶劑峰，δ 3.14 處為季銨鹽側(cè)鏈中—+N(CH3)3上H 的最大吸收峰，δ 2.71 為殼聚糖分子骨架上H2 的質(zhì)子峰，δ 3.32～4.43 為H3、H4、H5 和H6、H6′的質(zhì)子峰，這與文獻(xiàn)[11]報(bào)道吻合，表明季銨鹽已接枝到殼聚糖上得到目標(biāo)產(chǎn)物。在GH-HTCC 的譜線中，δ 1.34 是羥丙基海因環(huán)上—CH3(a)上H 的最大吸收峰[10]見環(huán)氧海因已接枝到HTCC 殘留羥基上，這與FTIR 的結(jié)果一致。由1H NMR 譜圖進(jìn)一步說明產(chǎn)物為目標(biāo)產(chǎn)物GH-HTCC。

圖4 HTCC 和GH-HTCC 的1H NMR 譜圖

2.3 產(chǎn)物的UV 分析

以甲醇為溶劑，配制一定濃度的海因、環(huán)氧海因和O-羥丙基(5,5-二甲基海因)-N-(2-羥丙基三甲基氯化銨)殼聚糖的甲醇溶液，以溶劑為空白對(duì)照，在190～400nm 范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，測(cè)定其紫外吸收光譜如圖5。海因（原料）、GH 和GH-HTCC 的最大吸收峰依次為200 nm、215 nm、209 nm，這是因?yàn)榛衔锝Y(jié)構(gòu)的變化，引起海因環(huán)結(jié)構(gòu)的特征吸收峰發(fā)生偏移[12]。由GH-HTCC 的紫外吸收?qǐng)D說明環(huán)氧海因已接枝到季銨化殼聚糖上。

2.4 產(chǎn)物的元素分析

圖5 DMH、GH 和GH-HTCC 的UV 圖

表1 產(chǎn)物的元素分析結(jié)果

產(chǎn)物的元素分析結(jié)果見表1，按作者課題組[3]的方法計(jì)算產(chǎn)物的取代度。由表1 可以看出，原料 CS 的脫乙酰度是83.25%，HTCC 的取代度達(dá)82.73%，考慮到殼聚糖16.75%的N-乙酰化，小季銨鹽基本達(dá)到完全取代。而GH-HTCC 的取代度隨著反應(yīng)時(shí)間（6h、12h、24h）的增長(zhǎng)而增加，環(huán)氧海因的取代度依次為19.56%、28.08%和35.71%，環(huán)氧海因取代度的提高增加了產(chǎn)物的氨基量，而氨基量的增加可以改善其對(duì)細(xì)菌的抗菌活性[6]。

2.5 產(chǎn)物的抗菌活性

2.5.1 產(chǎn)物的抑菌率

殼聚糖是天然抗菌高分子，但是只有在稀酸中溶解才能表現(xiàn)出其抗菌活性。而季銨鹽和環(huán)氧海因改性的產(chǎn)物能溶于pH 值1～14 的水溶液中，擴(kuò)大了使用pH 值范圍。按照1.4.2 節(jié)操作測(cè)定所合成產(chǎn)物對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌（E. coil）和革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌（S. aureus）的抑菌率，結(jié)果如圖6 所示?？梢?，產(chǎn)物對(duì)E. coil 和S. aureus 都有一定的抗菌活性，但是對(duì)S. aureus 的抗菌效果更強(qiáng)，這與作者課題組[3]的研究結(jié)果一致，這可能是由兩種菌種細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的差異所致，革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁最外層脂多糖阻止大分子對(duì)其干擾。O-羥丙基(5,5-二甲基海因)-N-(2-羥丙基三甲基氯化銨)殼聚糖的抗菌活性優(yōu)于N-(2-羥丙基三甲基氯化銨)殼聚糖，并且隨著環(huán)氧海因取代度的提高，GH-HTCC 的抗菌活性增強(qiáng)。這可能是因?yàn)镺 上引入的氮雜環(huán)增加了產(chǎn)物的氨基含量，螯合了細(xì)胞體內(nèi)的金屬離子、微量元素或者其他必要的營養(yǎng)物質(zhì)，干擾細(xì)菌的正常新陳代謝，從而提高了GH-HTCC 對(duì)細(xì)菌的抗菌活性[6]。所合成的GH-HTCC1 的抗菌活性（E. coli 58.9%；S. aureus 92.6%）比chitosan-GH[5]（E. coli 3.93%; S. aureus 39.7%）的抗菌活性強(qiáng)，這是因?yàn)镚H-HTCC 比chitosan-GH 多了一個(gè)帶正電荷的季銨鹽基團(tuán)，能與細(xì)胞膜上所帶的負(fù)電荷發(fā)生靜電作用，膜的滲透性發(fā)生改變且屏障功能喪失導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制或死亡[2]。

圖6 產(chǎn)物HTCC 和GH-HTCC 對(duì)E. coli 和S. aureus 的抑菌率

2.5.2 EDTA 對(duì)產(chǎn)物抗菌活性的影響

采用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定了乙二胺四乙酸（EDTA）對(duì)E. coil 和S. aureus 的抗菌活性，結(jié)果如圖7 所示，EDTA 是一種螯合劑，有一定的抗菌活性，并且隨著濃度的增大其抗菌活性逐漸增強(qiáng)。這是因?yàn)镋DTA 通過螯合能夠穩(wěn)固革蘭氏陰性菌脂多糖和革蘭氏陽性菌肽聚糖的鈣離子與鎂離子從而破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，且使生物體內(nèi)的磷脂酶釋放，進(jìn)而降解質(zhì)膜[13]。EDTA 對(duì)革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的抗菌活性優(yōu)于革蘭氏陰性菌大腸桿菌，這可能是因?yàn)閮煞N菌種細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不同所致[3]。

圖7 EDTA 對(duì)E. coli 和S. aureus 的抑菌率

按照1.4.2 節(jié)的操作，試驗(yàn)了添加1mmol/L、2mmol/L、4mmol/L、6mmol/L 的EDTA 對(duì)N-(2-羥丙基三甲基氯化銨)殼聚糖強(qiáng)和O-羥丙基(5,5-二甲基海因)-N-(2-羥丙基三甲基氯化銨)殼聚糖抗菌活性的影響，結(jié)果如圖8 和圖9 所示?？梢钥闯霎?dāng)EDTA 濃度為1mmol/L 時(shí)，EDTA 大大促進(jìn)產(chǎn)物的抗菌活性。隨著EDTA 濃度的提高產(chǎn)物的抗菌活性降低，甚至使HTCC 對(duì)S. aureus 的抑菌率低于未添加EDTA 的抑菌率。這可能是因?yàn)樵贓DTA 濃度較低時(shí)，EDTA 的螯合作用[13]和產(chǎn)物所帶正電荷共同破壞細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)[2]，提高產(chǎn)物的抗菌活性。而在EDTA 濃度較大時(shí)，EDTA 與產(chǎn)物的這種協(xié)同作用減弱，這可能是因?yàn)镋DTA 除了干擾細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和微量元素的螯合外，所含的COO-能與產(chǎn)物的季銨基團(tuán)發(fā)生靜電作用[14]，從而逐漸減弱上面所述兩者的協(xié)同作用，進(jìn)一步說明帶正電荷的季銨基團(tuán)能提高產(chǎn)物的抗菌活性。并且當(dāng)EDTA 濃度較高時(shí)，其對(duì)GH-HTCC 抗菌性能的影響大于HTCC。這可能是因?yàn)镋DTA 不僅與GH-HTCC 的季銨基團(tuán) 發(fā)生作用，還與它的氮雜環(huán)發(fā)生螯合[15]，從而進(jìn)一步削弱GH-HTCC 的抗菌活性，證明氨基量的多少影響到產(chǎn)物的抗菌活性。

圖8 EDTA 對(duì)HTCC 抗菌活性的影響

圖9 EDTA 對(duì)GH-HTCC 抗菌活性的影響

3 結(jié) 論

采用實(shí)驗(yàn)室自制的環(huán)氧海因?qū)句@化殼聚糖進(jìn)行改性，制備O-羥丙基(5,5-二甲基海因)-N-(2-羥丙基三甲基氯化銨)殼聚糖衍生物?？咕Y(jié)果表明，引入小季銨鹽增加了殼聚糖的抗菌活性，進(jìn)一步引入的氮雜環(huán)也提高了HTCC 的抗菌活性。并且常用食品添加劑EDTA 影響產(chǎn)物的抗菌活性，低濃度的EDTA 增強(qiáng)了HTCC 和GH-HTCC 的抗菌活性，而高濃度的EDTA 在一定程度上抑制了二者的抗菌活性。研究結(jié)果為GH-HTCC 抗菌劑在食品等領(lǐng)域的應(yīng)用提供依據(jù)。

致 謝

感謝華僑大學(xué)分子藥物研究所刁勇老師及其學(xué)生在抗菌測(cè)試方面的大力支持和幫助。

[1] Kumar M N V R，Muzzarelli R A A，Muzzarelli C，et al. Chitosan chemistry and pharmaceutical perspectives[J].Chemical Review，2004，104：6017-6084.

[2] Qin C Q，Xiao Q，Li H，et al. Calorimetric studies of the action of chitosan-N-2-hydroxypropyl trimethyl ammonium chloride on the growth of microorganisms[J]. International Journal of Biological Macromolecules，2004，34：121-126.

[3] Xu T，Xin M H，Li M C，et al.Synthesis，characteristic and antibacterial activity of N,N,N-trimethyl chitosan and its carboxymethyl derivatives[J]. Carbohydrate Polymers，2010，81：931-936.

[4] 魏文瓏，溫艷珍，李彥威，等. 海因類殺菌劑的研究進(jìn)展[J]. 山西化工，2005，25（1）：11-14.

[5] Li R，Pei H，Ren X H，et al. Antimicrobial N-halamine modified chitosan films[J].Carbohydrate Polymers，2013，92：534-539.

[6] Yang J H，Cai J，Hu Y，et al. Preparation，characterization and antimicrobial activity of 6-amino-6-deoxychitosan[J]. Carbohydrate Polymers，2012，87：202-209.

[7] Liang J，Chen Y J，Ren X H，et al. Fabric treated with antimicrobial N-halamine epoxides[J]. Industrial Engineering Chemistry Research，2007，46：6425-6429.

[8] 毛揚(yáng)帆，李明春，辛梅華，等. O-季銨化改性殼聚糖固載環(huán)糊精的制備及其載藥性能[J].化工進(jìn)展，2010，29（9）：1705-1709.

[9] Espinosa M H，Del Toro P J O，Silva D Z. Microstructural analysis of poly(glycidyl methacrylate) by1H and13C NMR spectroscopy[J]. Polymer，2001，42：3393-3397.

[10] Kou L，Liang J，Ren X，et al. Synthesis of a water-soluble siloxane copolymer and its application for antimicrobial coatings[J]. Industrial & Engineering Chemistry Research，2009，48：6521–6526.

[11] Cho J，Grant J，Piquette M M，et al. Synthesis and physicochemical and dynamic mechanical properties of a water-soluble chitosan derivative as a biomaterial[J]. Biomacromolecules，2006，7：2845-2855.

[12] 劉宏民. 實(shí)用有機(jī)光譜分析[M]. 鄭州：鄭州大學(xué)出版社，2008：14-16.

[13] Lisbeth T H，John W A，Tom A G. Antibacterial effect of protamine in combination with EDTA and refrigeration[J]. International Journal of Food Microbiology，2001，66：149-161.

[14] Chung Y C，Wang H L，Chen Y M，et al. Effect of abiotic factors on the antibacterial activity of chitosan against waterborne pathogens[J]. Bioresource Technology，2003，88：179-186.

[15] Amany A E S，Mohamed H. Chitosan-EDTA new combination is a promising candidate for treatment of bacterial and fungal infections[J]. Current Microbiology，2011，62：739-745.